[發明專利]叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法

在審

• 申請號: 202310071803.5
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN115968672A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發明（設計）人: 劉濤;李佳;字淑慧;楊生超;李穎
• 申請（專利權）人: 云南農業大學
• 主分類號: A01G7/06
• 分類號: A01G7/06;A01N63/30;A01N37/44;A01P21/00;C12Q1/18;G01N21/84;G01N1/31;C12R1/645
• 代理公司: 昆明金科智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1，煙草育苗，兩葉一心時進行移栽；

煙草品種選用紅花大金元，其特性是易感病；

步驟2，移栽時叢枝菌根接種，5天后噴施β-氨基丁酸；

叢枝菌根真菌孢子，選用隱類球囊霉和β-氨基丁酸外施誘導劑，誘導煙草植株產生抗病性；

步驟3，移栽30天后將疫霉菌接種到疫霉受體植株的莖部；

煙草疫霉菌株經馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA：200g馬鈴薯，20g葡萄糖和15g瓊脂，1000ml水)重新培養培養15天使用；

步驟4，植株表現出明顯的黑脛病后，對植株的氣體交換參數進行測定以及取樣；

移栽30天后將P.nic接種到疫霉受體植株的莖基部，植株表現出明顯的黑脛病后，測定植株的氣體交換參數；

接種煙草黑脛病病原菌P.nic15天后，在上午8:00～11:00對其中5株煙草植株的第二個充分展開葉片自上而下進行氣交換測定；

利用便攜式光合系統生成凈光合速率、胞間CO₂濃度、氣孔導度和蒸騰速率氣體交換參數數據，采用光控、溫控系統的開放式紅外氣體分析儀每一片葉子樣本；然后進行取樣，取樣部位為植株的3、4葉片，樣品立即保存于液氮中用于后續指標測定；

步驟5，測定植株N、P、K的含量、植株干重、叢枝菌根定殖率、病害指數、防治效果、過氧化氫、丙二醛、根系活力、超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸酶、還原性谷胱甘肽含量、脯氨酸含量、總酚含量和黃酮類化合物含量。

2.根據權利要求1所述的叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，步驟2中，在移栽煙草時，將AMF處理植株的幼苗根部附近添加AMF接種物，AMF接種物含有孢子、土壤、玉米根段，每盆添加10克，每克約680個孢子；未接受AMF處理的植株接種相同數量經過高壓滅菌過的AMF接種物，接種42天后觀測AMF的定殖情況；從煙草植株移栽第5天開始，每隔5天，采用2.5mM的BABA進行噴施植株，十字期后采用5mM的BABA進行噴施，噴施無菌水為對照處理。

3.根據權利要求1所述的叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，步驟3中，馬鈴薯葡萄糖瓊脂由如下重量法的原料組成：

馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g和水1000ml。

4.根據權利要求1所述的叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，步驟4中，在氣體交換實驗中，保持空氣溫度25℃，相對濕度80-90％，分別加入流量500μmol/sCO2，光照強度1000μmo?l/(m2﹒s)。

5.根據權利要求1所述的叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，步驟5中，新鮮收獲的根被切碎成1cm長的碎片，并在FAA固定液中4℃保存；測定時將儲存溶液中的根系用蒸餾水沖洗兩次，用20％的氫氧化鉀進行固定；接下來用2％的HCl進行酸化，然后用0.05％的臺盼藍溶液染色經過一整夜的染色，根被保存在甘油：乳酸：蒸餾水中，直到安裝在載玻片上進行顯微鏡檢查；每個處理測定20段根系，觀察有被定殖的根系進行記錄；根據每段根系菌根結構的多少，按0、1％、10％、50％、50％、90％的定殖量進行分級。

6.根據權利要求1所述的叢枝菌根和β-氨基丁酸協同誘導煙草提高抗黑脛病的方法，其特征在于，步驟5中，按以下公式進行計算：AMF定殖率＝∑M％·n/N；M％代表單個根段的定殖率，n表示相同定殖率的根段數，N代表每個處理的根段總數。