[發明專利]一種基于連鎖基因突變檢測MRD標志物的裝置

有效

• 申請號: 202310063877.4
• 申請日: 2023-01-12
• 公開（公告）號: CN116064755B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 肖敏;朱洲杰;張煒;楊曉霞;沈克鋒;張美蘭;穆偉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;G16B20/50;G16B50/30;C12Q1/6886
• 代理公司: 北京眾達德權知識產權代理有限公司 11570
• 代理人: 劉杰

本申請涉及生物基因技術領域，尤其涉及一種基于連鎖基因突變檢測MRD標志物的裝置。本發明建立了一種基于連鎖突變的MRD監測裝置。相比于其他流式細胞方法和PET?CET方法，本發明方法樣本獲取簡單，僅需要患者血液，操作方便，無放射性傷害；相比于PCR定量方法，本發明能一次檢測多個位點，并且檢測下限可達10supgt;―6/supgt;級別，可有效地進行MRD術后評價和復發監控，隨后根據患者個體情況開展精準指導；本發明不依賴于UMI分子標簽技術，當僅使用常規方法進行cfDNA建庫時，本發明檢測下限也可達到10supgt;―5/supgt;級別，相對于雙重測序技術，本發明節約實驗建庫成本，能有效提高原始片段的利用率。

技術領域

本申請涉及生物基因技術領域，尤其涉及一種基于連鎖基因突變檢測MRD標志物的裝置。

背景技術

根據國家癌癥中心發布的最新統計數據，2016年我國癌癥新發病例為406.4萬例，死亡病例為241.4萬例。而根據最新世界衛生組織國際癌癥研究機構，2020年中國新發癌癥457萬人，死亡病例300多萬。對比已有統計數據，我國整體癌癥粗發病率仍處于持續上升趨勢，粗死亡率也是仍然處于上升趨勢。并且隨著中國人口老齡化加劇，中國癌癥負擔將逐漸加大，加大對癌癥預防和治療的研究投入，將有助于降低未來的癌癥負擔。死亡癌癥患者的絕大部分是晚期患者，晚期腫瘤患者死亡率較高的原因，大多數并非是手術或者治療不成功，而是經過各種綜合治療之后，體內仍殘余少部分腫瘤細胞，這部分細胞定位為微小殘留病灶(MRD，minimal?residual?disease)，并且隨著時間推移，這部分細胞殘余會發展成新的病灶。

通過技術手段對MRD進行監測，能夠監測腫瘤復發可能性，根據病人的風險程度進行分層管理，定制精準化治療方案。MRD的技術監測手段包含正電子發射斷層成像-X線計算機斷層成像儀技術(PET-CT)、流式細胞技術、數字PCR技術和NGS技術等等。PET-CT技術通過監測細胞代謝物葡萄糖進行判斷腫瘤組織判斷，但是該技術具有放射性，并且針對一些感染性病變、血糖過高等情況存在假陽性。流式細胞技術運用不同熒光標記物的多種抗體組合對細胞表面表達情況進行檢測，進而區分細胞來源，然而活細胞的提取限制了流式細胞在MRD的應用。數字PCR技術對異常的DNA或者RNA片段進行擴增，進而定量。由于成本限制，該技術僅能對1個或少數幾個突變進行監測，故存在假陰性可能。通過對外周血游離DNA(circulating?free?DNA，cfDNA)進行NGS檢測，對患者來說無需通過手術進行組織提取，能夠一次檢測多個位點，大大提高檢測的靈敏度，并且對于腫瘤的克隆演化也有較好的監控作用。

通過cfDNA測序進行MRD監測，主要有兩個關鍵制約因素：1.經過綜合治療之后，血漿中循環腫瘤DNA(circulating?tumor?DNA，ctDNA)劑量極少；2.存在較多的測序實驗過程中引入的背景噪音。目前大部分通過分子標記測序技術(unique?molecular?identifiers，UMI)來降低背景噪音，但是該方法需要測序較為飽和來實現校正算法，并且該方法受限于DNA雙鏈分子回收率，僅能有效利用到20至25％的原始片段。此外，目前該技術的主要應用方法，均為基于多個突變位點中每一個突變位點的真假進行獨立判斷，該策略將會大大影響檢測的靈敏度，目前基于NGS測序進行單個突變位點的陽性判定的檢測下限基本在0.1％至0.5％之間。

綜上所述，現有技術中陽性判定的檢測下限偏低，影響了檢測結果容易造成誤判。

發明內容

為了解決背景技術中存在的問題，本發明建立了一種利用連鎖突變計算腫瘤MRD的方法及對應的數據存儲計算裝置，通過患者初診時的任何檢測手段(如靶向測序、全外顯子測序或者全基因組測序等)所獲得的初診連鎖突變作為基線，進行超高靈敏度的MRD監測。具體內容如下：

第一方面，本發明提供了一種連鎖基因突變數據庫構建方法，包括：

提取若干個正常人的cfDNA進行雙端測序，獲取測序數據作為樣本數據，使用hg19參考基因組進行對比，獲得比對信息，并標記重復片段；