[發明專利]非人靈長類動物孤獨癥模型的構建方法

在審

• 申請號: 202310063170.3
• 申請日: 2023-01-17
• 公開（公告）號: CN116098125A
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 李邦;楊偉莉;李曉江;羅涯鋒;張家瑋;涂著池;郭祥玉;殷鵬;李岳鋒
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;A61D7/00
• 代理公司: 廣州海心聯合專利代理事務所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

本發明公開了一種非人靈長類動物孤獨癥模型的構建方法，該方法包括以下步驟：在雌性非人靈長類動物妊娠期第55±1天，向其胎兒側腦室中注射CHD8sgRNA/Cas9病毒，然后正常飼養，待胎兒出生后即獲得非人靈長類動物孤獨癥模型。本發明成功模擬了胚胎期進行CHD8基因突變造成靈長類動物大腦膠質細胞增生的重要病理特征，該方法便于批量建模，而目前并沒有利用該建模方法研究CHD8基因突變在靈長類腦中的早期病理特征的相關報道。本發明采用胚胎腦基因編輯造成腦組織中CHD8基因突變,該項研究為深入探究靈長類腦中孤獨癥腦發育障礙機理、開發孤獨癥治療靶點及臨床前藥物篩選提供了有效模型及重要方法。

技術領域

本發明涉及動物疾病模型，具體涉及一種非人靈長類動物孤獨癥模型的構建方法。

背景技術

孤獨癥譜系障礙(autism?spectrum?disorder，ASD)也叫自病癥，是一類廣泛性發育障礙，嚴重影響兒童早期發育，主要表現為不同程度的人際交往障礙、刻板行為、語言發育障礙和興趣狹隘等。研究認為孤獨癥起因包含遺傳和環境因素，遺傳因素占25％左右，和孤獨癥有關的風險基因約800個，具有高度遺傳復雜性。

CHD8基因(Chromodomain?Helicase?DNA-binding?Protein?8)在眾多孤獨癥關聯突變基因中突變率高達0.5％，是一個重要的候選致病基因。CHD8基因位于染色體14q11.2結構域，編碼一種染色體結構域解旋酶DNA結合蛋白8，該蛋白可與p53、βcatenin等轉錄因子結合，具有復雜的轉錄調控作用。臨床上CHD8突變患者多為雜合突變，患者的主要臨床特征包括輕度智力障礙、巨頭畸形、社交障礙、肌張力減退、注意力缺陷、攻擊行為和癲癇發作等。

以人類孤獨癥患者為研究對象受倫理、實驗手段等限制，制約深入解析基因、神經回路、腦區解剖結構和行為之間的相互關系，因此動物模型被廣泛用來研究孤獨癥的發病機理。目前CHD8突變的小鼠模型具有較大的表型及病理異質性，不能完全模擬孤獨癥病人的重要病理及行為特征。考慮到嚙齒類動物與靈長類動物大腦在發育及結構上具有明顯區別，比如嚙齒類動物大腦表面缺乏溝回及缺乏負責靈長類大腦皮層擴張的oSVZ區域等，因此利用與人類更為接近的猴模型研究CHD8基因突變所造成的臨床重要病理特征及機制具有重要意義。

近些年來，隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術成熟，MECP2和SHANK3基因是造成遺傳學孤獨癥的重要基因，已用來構建非人靈長類模型。已公開的孤獨癥猴模型構建方法采用受精卵打靶建模，此種方法雖然能很好的模擬孤獨癥風險基因在發育中的作用，但周期長、成本高和脫靶問題難以解決，限制了該方法的廣泛應用。采用VPA和MIA抗體處理孕期靈長類動物的傳統孤獨癥造模方法，雖然其后代會表現出社交、刻板行為等自閉樣行為，但無法模擬某特定致病基因的作用機制。

發明內容

本發明的目的在于提供一種非人靈長類動物孤獨癥模型的構建方法，通過對CHD8sgRNA/Cas9病毒注射時期和注射部位的改進，獲得一種性狀明顯、穩定的靈長類動物孤獨癥模型。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

非人靈長類動物孤獨癥模型的構建方法，包括以下步驟：

在雌性非人靈長類動物妊娠期第55±1天，向其胎兒側腦室中注射CHD8sgRNA/Cas9病毒，然后正常飼養，待胎兒出生后即獲得非人靈長類動物孤獨癥模型；

所述注射CHD8?sgRNA/Cas9病毒的時間，是神經細胞發生增殖分化的重要時期，和CHD8基因在腦中表達密切相關。

所述的非人靈長類動物優選食蟹猴、獼猴等。

所述的CHD8?sgRNA/Cas9病毒，其中sgRNA和慢病毒Cas9體積比為1：2，病毒滴度為1×10⁹vg/ml，注射量100-200μl，注射速度優選20μl/min；