[發(fā)明專利]一種胰島素或其類似物中殘留賴氨酰內(nèi)切酶的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310062667.3
• 申請(qǐng)日: 2023-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN115808484B
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曹海燕;顧志強(qiáng);周彥航;任屏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/30;G01N30/32;G01N30/34;G01N30/74;G01N30/86
• 代理公司: 北京開陽星知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

1.一種胰島素或其類似物中殘留賴氨酰內(nèi)切酶的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法至少包括以下步驟：

S1、分別配制底物溶液、Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液、稀釋液和待測(cè)樣品溶液；所述底物為艾塞那肽；

S2、取所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液、底物溶液和稀釋液，按比例混合后，進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，得到陽性對(duì)照品反應(yīng)液；所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液中的賴氨酰內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)品和所述底物的質(zhì)量比1：40000~?55000；所述底物溶液的濃度為0.5?~?2mg/mL，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液中?Lys-C酶的濃度為0.2?~?1?μg/mL；

S3、取超純水、所述底物溶液和所述待測(cè)樣品溶液，混合后在與S2相同條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，得到待測(cè)樣品反應(yīng)液；

其中，超純水的體積等于S2中所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液的體積，所述待測(cè)樣品溶液體積等于S2中所述稀釋液的體積；S2和S3中底物溶液用量相同；所述待測(cè)樣品溶液中胰島素或其類似的濃度為10?~?30?mg/mL；

S4、對(duì)所述陽性對(duì)照品反應(yīng)液和所述待測(cè)樣品反應(yīng)液分別進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，比較酶切肽段的峰面積，判斷所述待測(cè)樣品中賴氨酰內(nèi)切酶殘留是否超過陽性對(duì)照品溶液的濃度；

所述高效液相色譜檢測(cè)的條件為：

色譜柱選自C18反相色譜柱；

流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%TFA的水溶液，流動(dòng)相B為含有0.1%TFA的乙腈；

流速：1.0?mL/min；

柱溫：50℃；

檢測(cè)波長：214?nm。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2、S3中，所述酶切反應(yīng)的條件相同，均為35?~?40℃條件下反應(yīng)5?~?15小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液中的賴氨酰內(nèi)切酶標(biāo)準(zhǔn)品和所述底物的質(zhì)量比1：50000。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2中，所述底物溶液的濃度為1mg/mL，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液中?Lys-C酶的濃度為0.5?μg/mL，

S3中，所述待測(cè)樣品溶液中胰島素或其類似的濃度為20?mg/mL。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液、所述底物溶液和所述稀釋液的體積比為1：25：25；

S3中，所述超純水、所述底物溶液和所述待測(cè)樣品溶液的體積比為1：25：25。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液、所述底物溶液和所述稀釋液的體積分別為10?μL、250?μL和250?μL；

S3中，所述超純水、所述底物溶液和所述待測(cè)樣品溶液的體積分別為10?μL、250?μL和250?μL。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，S2和S3中均通過加入10?μL的1.5mol/L醋酸溶液終止反應(yīng)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述底物溶液和所述待測(cè)樣品溶液均采用稀釋液配制；所述稀釋液為0.05?mol/L的Tirs-HCl緩沖液，pH為8.0。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述Lys-C酶陽性對(duì)照品溶液中?Lys-C酶的濃度為A，其在S2和S3中用量分別為V_a，所述待測(cè)樣品中胰島素或其類似物的濃度為B，其在S2和S3中用量分別為V_b，則在S4中，根據(jù)酶切肽段峰面積的比較，判斷所述待測(cè)樣品中Lys-C酶的含量是否超過檢測(cè)限（A×V_a）/（B×V_b）。