[發明專利]一種魚腥藻化學誘變的方法

在審

• 申請號: 202310058150.7
• 申請日: 2023-01-18
• 公開（公告）號: CN115960882A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 劉翠敏;張世佳;劉會麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N1/20;C05F11/08;C12R1/01
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 喬獻麗;張瑩

本發明提供魚腥藻化學誘變的方法，所述方法包括使用誘變劑亞硝基胍對魚腥藻進行誘變處理，其中亞硝基胍的誘變濃度為0.1g/L，誘變時長為1?2h，誘變環境條件：22℃下避光靜置處理，誘變結束后離心收集藻體，22℃下避光恢復培養。本發明誘變獲得的魚腥藻相比于野生型魚腥藻生長明顯加快，且適應田間溫度，對于在更廣的地域和不同氣候特點下繁殖和應用魚腥藻的固氮特性，改善和提升土壤肥力，甚至促進化肥的減施增效，具有廣泛應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及魚腥藻的化學誘變方法。

背景技術

固氮藍藻適合在18-38℃生長，最適溫度為28-35℃，已知有33個屬150多種具有固氮作用，其中多數屬于魚腥藻、念珠藻、簡孢藻、單岐藻、項圈藻、眉藻等(沈銀武等，1993)。固氮藍藻生長在諸如銨態氮或硝態氮的氮源培養基上時，生長成以光合作用細胞為主的藻體，但在氮源缺乏時，通過增強呼吸作用，丟失光系統Ⅱ和藻膽體，在細胞壁形成氣體擴散的障礙夾層，從而專門特化出一部分細胞形成含有高度厭氧固氮酶的異形胞，發揮生物固氮功能(Maldener?I?et?al.2003)。迄今為止，共有三類基因不同，但結構和機制相似的固氮酶被報道(Bishop?P.E.et?al.1986；Chisnell?J.R.et?al.1988；Dos?Santos?P.C.etal.2011)。其中最具代表性的是鉬依賴的固氮酶，其包含兩個催化部分，二聚體的鐵蛋白和四聚體的鉬鐵蛋白(Rubio?LM.et?al.2005；Jimenez-Vicente?E.et?al.2018)。

第一次綠色革命是作物優良性狀和化肥和農藥兼施的共同成果，它在提振全球糧食供給的同時，所帶來的問題也愈加凸顯。如：化肥連年過度施用造成土壤生態結構惡化，加劇環境污染，農業成本逐漸增加，種質優勢退化等。為了保障糧食增產的可持續性，越來越多的研究開始將目光投向共生領域，如根瘤共生、菟絲子共生、稻藻共生等。這類研究一方面降低共生生物對作物的負面影響，另一方面充分發揮它們在生物固氮、經濟價值等方面的優勢，成為關系國計民生的重要研究方向之一。針對化肥的減施增效，藍藻的固碳和固氮性質賦予它們作為優良綠肥的巨大潛質，早在1939年就有研究指出固氮藍藻可為水稻田提供氮肥(De?P.，1939)，隨后有跟進試驗發現接種藍藻后的稻田可增產5-30％，我國在1978年發表的論文中顯示，晚稻田養藻水稻實現增產10％(中國科學院水生生物研究所第五室藻類實驗生態學組1978)。將藍藻作為綠肥來源另一個重要意義就是實現變廢為寶。當下工業廢水和廢料引發環境污染的事件時有發生，如對養殖業和淡水湖泊養護造成巨大損失的“水華”，“罪魁禍首”正是在富營養化水體中爆發式增殖的藍藻。藍藻自發利用富營養化的廢水，在適合溫度和光照條件下快速繁殖，體現了其在環境治理上的天然優勢。對廢水物料的排放，藻種播撒與收集加以科學調配，全面納入可控范疇，即可實現廢物利用和化肥減施的雙贏。

我國稻區雖然分布廣泛，但主要集中在長江中下游和東北的黑龍江地區。固氮藍藻的適宜生長溫度通常為25℃，過高或過低的環境溫度均會降低其生長速度，極大限制了利用固氮藍藻對土壤肥力進行改善的策略實施。對藻種進行誘變篩選以獲得適宜特定環境施用的藻種是行之有效的方法之一。藻類的誘變方式主要有物理射線誘變、化學誘變和自然突變分離(黃開耀等，1998)。利用紫外或γ射線對鈍頂節旋藻進行照射誘變就是通過物理方式獲得了大量突變體(曹媛媛等，2006)。相對而言，化學誘變在誘變劑種類、誘變濃度、處理時長、誘變設施等方面均具有調節方式靈活，便于開展的獨特優勢。如殷春濤等利用亞硝基胍(NTG)誘變獲得螺旋藻新品種(殷春濤等，1997)，關劍使用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變選育獲得耐低溫的節旋藻(關劍，2017)。但針對普遍具有固氮功能的魚腥藻誘變方法卻鮮有報道，成為制約該類藍藻走向實際應用的瓶頸所在。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供以下技術方案：

一方面，本發明提供魚腥藻的誘變方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

a.誘變前處理：離心收集魚腥藻，并使用緩沖溶液重懸藻體，重復離心及重懸以去除培養基成分，為后續孵育提供單一誘變環境；