[發明專利]‘豆綠’牡丹的內參基因及其引物和應用

在審

• 申請號: 202310052252.8
• 申請日: 2023-02-02
• 公開（公告）號: CN116287378A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 周爽;馬超;高雙成;史國安;周文斌;侯典云
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/686
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 王艷艷

本發明涉及‘豆綠’牡丹的內參基因及其引物和應用，屬于生物技術領域，本發明以綠色牡丹‘豆綠’為試驗材料，分析9個候選內參基因的表達穩定性，結果表明UBC和MBF1A在‘豆綠’不同組織中最穩定；GAPDH和ACT在‘豆綠’不同發育時期瓣化雄蕊中最穩定。本發明構建了穩定可靠的‘豆綠’定量檢測體系，為‘豆綠’牡丹中的基因表達分析及‘豆綠’花型及花色形成分子機理研究提供了依據，為延長‘豆綠’花朵著色時間，提高其觀賞品質提供技術支持，并為其他品種綠花牡丹的持綠研究提供參考，還可以為后續培育牡丹綠色花新品種提供理論依據。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及園林、園藝、分子育種領域，具體涉及‘豆綠’牡丹的內參基因及其引物和應用。

背景技術

實時熒光定量PCR(quantitative?Real-time?PCR,qRT-PCR)技術是分子生物學中檢測相關基因表達情況的最普遍的技術方法之一。qRT-PCR技術操作簡便、特異性好、靈敏度高、高效快捷，目前已經成為基因功能研究必需的基礎檢測手段。

在利用qRT-PCR技術進行基因表達情況分析時，為了消除不同RNA樣品之間可能對實驗結果造成的誤差，需要利用適合的內參基因對實驗結果進行校正。理想的內參基因應該表達水平較高，在不同的組織、不同的生長發育階段、不同的處理條件下均能穩定表達。篩選合適的內參基因是獲得可靠qRT-PCR分析結果的前提。

牡丹(Paeonia?suffruticosa)起源于我國，是名貴的觀賞和藥用植物，屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan?DC)，以碩大的花朵以及豐富多彩的顏色著稱，有“花中之王”的美譽。牡丹栽培品種在培育過程中經歷反復雜交，遺傳背景不清。Lv等對牡丹品種‘洛神曉春’進行了基因組測序，獲得了13.79Gb的基因組序列。‘洛神曉春’的轉錄組數據和基因組數據匹配率只有73.2％。其余4個公開報道的牡丹轉錄組數據和‘洛神曉春’基因組的匹配率更低，僅有0.04％-68.41％，說明不同牡丹品種之間存在高度的遺傳多樣性(Lv?et?al.，2020)，導致牡丹內參基因缺乏通用性。不同的牡丹品種適用的內參基因差異明顯，甚至同一牡丹品種、不同組織、不同處理條件適用的內參基因都各不相同。β-actin和b-tubulin在‘魯菏紅’花芽休眠解除過程中最穩定(張玉喜等，2011)；CYC和EF2α是滇牡丹種子中最穩定的內參基因組合(潘沫晗等，2020)。ubiquitin和GAPDH是‘洛陽紅’不同實驗條件下最穩定的內參基因組合(王彥杰等，2012)。Li?Jian等在3個牡丹品種6個發育時期的花瓣中檢測了10個候選內參基因的穩定性，研究結果表明GAPDH和UBC在‘鳳丹’和‘西施’中最穩定，EF-1α和UBC在‘雀好’中最穩定(Li?et?al.，2016)。劉洪峰等研究了‘鳳丹’、‘西施’、‘雀好’3個品種共33份樣本，對16個候選內參基因進行了篩選分析。在‘鳳丹’、‘西施’、‘雀好’3個品種不同發育階段的花瓣中，ERVTP和PP2CFP最穩定；在‘鳳丹’不同花色梯度的花瓣中，RPS9和ARFA1C最穩定；在‘鳳丹’不同組織中，AMPDS和PUF1639最穩定；在‘鳳丹’不同發育時期的種子中，RPS9和PUF1639最穩定(劉洪峰等，2015)。以上結果說明內參基因在不同牡丹品種中的穩定性差異極大，牡丹內參基因在不同品種、不同組織、不同處理條件下不能通用。在進行牡丹的基因表達分析時，需要對適合的內參基因組合進行篩選。