[發明專利]一種重組人源化膠原蛋白的制備方法

在審

• 申請號: 202310051220.6
• 申請日: 2023-02-02
• 公開（公告）號: CN115894668A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 喬瑞龍;田培華;田之林
• 申請（專利權）人: 南京匯創星美生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/78
• 分類號: C07K14/78;C12N1/16;C12P21/02;C07K1/30;C12R1/84
• 代理公司: 南京業騰知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32321
• 代理人: 楊靜

1.一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于：包括以下方法步驟，

S1，將畢赤酵母菌基因工程菌接種于種子罐中培養，待溶氧大幅度回升后轉移至生產發酵罐；

S2，將生產發酵罐內的畢赤酵母菌基因工程菌培養至溶氧大幅度回升后，使用復合原料進行混合碳源補料；

S3，結束混合碳源補料后，使用發酵液進行補料并持續進行發酵處理，發酵過程中保持注入補料氣體，保持300ml/min注入；

S4，使用緩沖液進行混合，然后進行提純處理；

S5，對提純后的原料進行消毒處理，即完成加工。

2.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，所述畢赤酵母菌基因工程制作方法如下，L1，先將畢赤酵母菌種放入3‰-10‰的培養基進行浸泡10-20min，再把原料清洗至中性，培養得到一級種子；

L2，將一級種子液按照10％～16％的接種量接種于35L種子罐中的底料培養基中，培養得到二級種子；

L3，待二級種子液溶氧大幅度回升后，按照17％～18％的接種量接種于150L種子罐中的底料培養基中，培養得到三級種子，再將三級種子放入發酵罐中進行發酵處理，發酵過程中采用6-8mol/L的碳酸氫鉀溶液，調節發酵液的pH，使發酵過程pH?2-6。

3.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟S1中，按照物料比1:3(w/v)-1:4(w/v)加入純化水，90-95℃滅菌20-30min，冷卻至30℃。

4.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟S1中，初次發酵過程中，PH控制在6.0-7.8，37-42℃保溫水解6-7h，然后離心過濾，取過濾清液；使用截留分子量為6000的超濾設備進行超濾，并補加純化水使超濾更加完全，取透出液。

5.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟S3中，所述補料氣體為氨氣、氮氣、氧氣及二氧化碳構成的混合物，且混合比例為1:1.2:1.4:1.5。

6.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟S4中，加入緩沖液重懸至120-230g/L→懸浮物使用高壓均質機裂解，離心收集裂解物上清，上清過濾去除不溶物雜質→上清中加入終濃度為80-180mM硝酸鎂，攪拌均勻后離心收集上清，PH調整至5.5→將pH處理后上清加入硝酸鎂顆粒鹽析至終濃度達到1.4-1.6M，離心收集鹽析沉淀→鹽析沉淀使用純化水溶解,1L水對1kg初始濕菌體,3h以上，離心收集上清并過濾除去顆粒或絮狀雜質，將該上清放入到10-25℃內維持6h以上，此時蛋白析出，低溫離心收集沉淀即可獲得粗品，再進行純化m。

7.根據權利要求1所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，步驟S2，所述復合原料為生理鹽水、雙氧水、碳酸銨構成的混合物。

8.根據權利要求2所述的一種重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于，所述培養基的成份為以下，葡萄糖1.5-3.0份，蛋白胨1.0-2.5份，酵母粉2.5-4份，瓊脂粉0.5-2.0份，硫酸鉀1.5-4份、維生素C0.5-1份、硫酸鎂1-3份。