[發(fā)明專利]一種狂犬病毒用Vero細胞培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310049631.1
• 申請日: 2023-02-01
• 公開（公告）號: CN116333969A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 吳季南;李舉;薛鳳波;儲明磊;胡德東;曹金良;李加樂
• 申請（專利權）人: 寧波榮安生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00
• 代理公司: 余姚德盛專利代理事務所(普通合伙) 33239
• 代理人: 戚秋鵬

本發(fā)明涉及狂犬病毒用Vero細胞擴增培養(yǎng)技術領域，具體為一種狂犬病毒用Vero細胞培養(yǎng)方法，在進行Vero細胞培養(yǎng)過程中，需要將Vero細胞從培養(yǎng)基中分離出來，通過將試管進行震蕩移動，使得磁棒在試管的徑向上進行移動，配合試管的自轉，使得磁棒覆蓋整個試管的橫截面，進而將吸附了Vero細胞的磁珠完全吸附，達到快速、徹底分離Vero細胞的目的，分離出的Vero細胞與狂犬病毒進行混合后進行快速培養(yǎng)，實現狂犬病毒用Vero細胞大量、快速的擴大培養(yǎng)。

技術領域

本發(fā)明涉及狂犬病毒用Vero細胞擴增培養(yǎng)技術領域，具體為一種狂犬病毒用Vero細胞培養(yǎng)方法。

背景技術

Vero細胞是日本學者1962年從非洲綠猴(cercopithecus?aethiops?monkey)腎建立的猴腎細胞系。其名稱的由來是取自世界語中“綠”字的VERDE前兩個字母和“腎”字前兩個字母合在一起，但世界語中不允許VERE存在，而需以“0”結尾，故命名為“Vero”。其第93代被帶到美國NIH的過敏與傳染病研究所熱帶病毒研究室，第113代被提交給ATCC，編號為ATCC?NO.CCL-81。

除了常規(guī)的科研需要之外，經過全面的研究鑒定，Vero細胞具有胞核學穩(wěn)定，沒有外源因子污染和致瘤性的優(yōu)點，完全符合1987年WHO關于用于生物制品的傳代細胞的規(guī)程要求，并已被WHO批準可用作疫苗生產的基質。于是，Vero細胞小兒麻痹滅活疫苗、小兒麻痹活疫苗、Vero細胞狂犬病疫苗相繼在法國被研制出來并獲批準生產。因此，Vero細胞的應用前景以及需求量極大。

而在Vero細胞用于狂犬病毒培養(yǎng)過程中，需要將Vero細胞從培養(yǎng)基中進行分離，而現有的干細胞分離方法主要有貼壁篩選法、骨組織消化法、密度梯度離心法、免疫磁珠分選法和流式細胞儀分離法，上述的幾種細胞分離方法中，僅免疫磁珠分選法是一種簡單高效的分離方法，僅需磁性分離器，不需要專業(yè)設備輔助，分離獲得BMSCs細胞通量高，其他幾種均需要較高的操作要求，技術難度高。

但是，現有的免疫磁珠分選法在對Vero細胞進行分離時，由于磁珠是游離在培養(yǎng)基中的，通過磁棒吸附磁珠，存在很難將磁珠完全吸附的技術問題。

發(fā)明內容

針對以上問題，本發(fā)明提供了一種狂犬病毒用Vero細胞培養(yǎng)方法，在進行Vero細胞培養(yǎng)過程中，需要將Vero細胞從培養(yǎng)基中分離出來，通過將試管進行震蕩移動，使得磁棒在試管的徑向上進行移動，配合試管的自轉，使得磁棒覆蓋整個試管的橫截面，進而將吸附了Vero細胞的磁珠完全吸附，達到快速、徹底分離Vero細胞的目的，分離出的Vero細胞與狂犬病毒進行混合后進行快速培養(yǎng)，實現狂犬病毒用Vero細胞大量、快速的擴大培養(yǎng)。

為實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種狂犬病毒用Vero細胞培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟a、細胞培養(yǎng)，用移液槍將Vero細胞專用培養(yǎng)基吸盡，加入3-5mlPBS洗滌細胞2-3次，向細胞培養(yǎng)皿中加入1-2ml的胰蛋白酶，于37℃條件下消化2-3min，加入2-3ml的新鮮的Vero細胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍吹打細胞培養(yǎng)皿底40-50次；將液體移至細胞離心管中，在1000-1200g/min條件下離心3-5min，用移液槍去除上清液，加入2-3ml新鮮的Vero細胞專用培養(yǎng)基，使用移液槍上下吹打細胞40-50次；平均加入到3-8個細胞培養(yǎng)皿中，進行貼壁擴大培養(yǎng)；

步驟b、分離收集細胞，將貼壁培養(yǎng)24-72小時的Vero細胞，用胰蛋白酶消化并通過免疫磁珠法分離收集細胞，其中，在通過免疫磁珠法分離Vero細胞時，在胰蛋白酶消化2-3min后，將細胞轉移至試管內，向試管內加入磁珠，通過震蕩臺使得磁珠在試管內分布均勻，磁珠吸附Vero細胞，之后將分離棒套與磁棒同步插入到所述試管內，使得試管內吸附了Vero細胞的磁珠被磁棒吸附，進而分離收集，在磁棒吸附磁珠過程中，所述試管自轉的同時，沿試管的徑向往復移動，使得磁棒完全吸附所述試管內的磁珠；