[發明專利]靶向SARS-CoV-2 RBD與其受體ACE2共享表位的駝源納米抗體

在審

• 申請號: 202310046416.6
• 申請日: 2023-01-31
• 公開（公告）號: CN116120443A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 王建勛;和似琦;王伽利;陳漢祎;錢朝暉;胡克平
• 申請（專利權）人: 深圳細胞谷生物醫藥有限公司;深圳北京中醫藥大學研究院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/13;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京玄法律師事務所 16002
• 代理人: 潘滿根

本發明提供靶向SARS?CoV?2RBD與其受體ACE2共享表位的駝源納米抗體，所述納米抗體或其抗原結合片段與SARS?CoV?2RBD的關鍵位點F486、Q493和S494同時結合。本發明篩選純化得到的納米抗體VHH5?05，不僅只對展示野生型SARS?CoV?2RBD的噬菌體表現出了強的結合能力，同時對Beta突變株RBD和Delta突變株RBD的噬菌體也表現出一定結合能力。

技術領域

本發明屬于抗體技術領域，具體涉及一種靶向SARS-CoV-2?RBD與其受體ACE2共享表位的駝源納米抗體，以及該抗體在預防和/或治療與SARS-CoV-2病毒感染相關的疾病中的用途。

背景技術

SARS-CoV-2是單鏈正義RNA包膜病毒，其膜表面表達有眾多的刺突蛋白(spikeprotein，S-protein，簡稱S蛋白)，由此形成了SARS-CoV-2的花冠外觀。S蛋白實際為同源三聚體蛋白，每個蛋白單體包含一個S1亞基(14–685aa)與一個S2亞基(686–1273aa)。S蛋白可識別并結合細胞膜表面的血管緊張素轉化酶2受體(angiotensin?converting?enzyme?2，ACE2)，并且在經過細胞表面的絲氨酸蛋白酶TMPRSS2的切割處理后，介導病毒包膜與細胞膜融合，促使病毒RNA基因組進入宿主細胞。這其中S1亞基的受體結合結構域(Receptor-binding?domain，RBD)是研究SARS-CoV-2與ACE2受體結合以及抗體識別的關鍵區域，被認為是迄今為止最有效的抗SARS-CoV-2中和抗體(neutralizing?antibodies,NAbs)的靶標。

中和抗體療法是人類應對重大公共衛生危機過程中的有利武器之一，因其能達到治療加預防的雙重效果而備受關注和期待。中和抗體發揮作用往往是通過與病毒RBD結合，進而阻止病毒吸附于ACE2受體，使其不能穿入胞內進行復制增殖，此外中和抗體與病毒形成免疫復合物，易被巨噬細胞吞噬清除。

駝源免疫球蛋白的單域抗體(single?domain?antibody，sdAb)是一種天然缺失輕鏈的抗體，只包含一個重鏈可變區和兩個常規的CH2與CH3區。單域抗體通過其重鏈上可變區結合抗原，該可變區可以單獨穩定地在體外存在，被稱為重鏈可變區單域抗體(variabledomain?of?heavy?chain?of?heavy-chain?antibody，VHH)或者納米抗體(nanobody，Nb)，分子量為12-15千道爾頓(KDa)，是目前已知的能與抗原結合的最小片段，相比傳統的單抗(150KDa)更進一步具有多個特征，例如存在更多的可獲得表位、相對較低的生產成本、更高的組織穿透力、在原核表達系統中也更易于生產等。

發明內容

在本發明中利用噬菌體展示技術進行納米抗體篩選，該技術利用基因工程方法，將外源性基因片段插入到噬菌體的基因組中，使其編碼的蛋白或多肽與噬菌體衣殼蛋白形成融合蛋白，得以展示于噬菌體表面。被展示的蛋白可以保持相對的空間結構和生物活性，因而以靶蛋白為“魚餌”釣出與其結合的目的蛋白，可達到對噬菌體庫的篩選。

基于噬菌體展示的方法、納米抗體的優良生物特性及RBD與ACE2結合介導病毒進入宿主細胞的基本原理，本發明是利用構建的噬菌體納米抗體免疫文庫，以野生型SARS-CoV-2?RBD(記為SARS-CoV-2?RBD?WT)為靶標抗原，采用RBD-ACE2競爭淘選的方法淘篩納米抗體，并對篩選得到的VHH進行表達和鑒定，針對SARS-CoV-2?RBD重組蛋白特異性結合的高親和力納米抗體。