[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)基及其在胎猴神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310040346.3
• 申請(qǐng)日: 2023-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN115927186B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何大健;郭祥玉;李曉江;李世華;楊偉莉;殷鵬;潘明天
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N5/0797
• 分類號(hào): C12N5/0797
• 代理公司: 廣州海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 王洪娟

本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基及其在胎猴神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基的基底培養(yǎng)基是DMEM/F12，此外還含有1％L?谷氨酰胺、2％B27無血清添加劑、5?20ng/mL?bFGF、5?20ng/ml?EGF、5?10μg/mL肝素、0.2mM?NEAA、1.5μg/mL?CHIR99021、10ng/mL?hLIF、0.1mM維C、抗生素適量。本發(fā)明培養(yǎng)基中，hLIF可抑制胚胎干細(xì)胞分化，促進(jìn)細(xì)胞自我更新，可用于培養(yǎng)胎猴神經(jīng)干細(xì)胞；同時(shí)CHIR99021是GSK3抑制劑，起到WNT激活劑的作用。與hLIF結(jié)合使用可從人類ES細(xì)胞中生成原始神經(jīng)干細(xì)胞并維持神經(jīng)干細(xì)胞自我更新能力和神經(jīng)原性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種培養(yǎng)基及其在胎猴神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural?stem?cell,NSC)是基礎(chǔ)科學(xué)研究和細(xì)胞替代療法治療神經(jīng)疾病的重要科研基礎(chǔ)。盡管成年哺乳動(dòng)物(包括人)的大腦中存有一定量的神經(jīng)干細(xì)胞，但是，數(shù)量非常有限，難以被大規(guī)模應(yīng)用。

雖然，由胚胎干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化出NSC,理論上可獲得無窮多的NSC。但是體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化出的NSC與體內(nèi)自然發(fā)育過程中的NSC仍有一定的差異。例如，在帕金森病的臨床治療中，移植胎兒間腦神經(jīng)組織可有效改善病癥，而移植胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的NSC看不到治療效果。因此，規(guī)模數(shù)量的胎兒NSC分離培養(yǎng)具有重要意義。

非人靈長類動(dòng)物(實(shí)驗(yàn)猴)具有與人類高度相似的腦結(jié)構(gòu)和腦功能，其神經(jīng)發(fā)育過程也與人類非常相近。因此，分離培養(yǎng)靈長類動(dòng)物(食蟹猴)胎兒期規(guī)模數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞具有重要的價(jià)值。

分離培養(yǎng)嚙齒類動(dòng)物胚胎期神經(jīng)干細(xì)胞的研究報(bào)道比較普遍，小鼠的大腦神經(jīng)發(fā)生期主要集中在胎兒發(fā)育的9-13天，普遍使用E11(懷孕11天)的胎兒進(jìn)行NSC分離培養(yǎng)，培養(yǎng)方式主要是懸浮式培養(yǎng)。

目前，有少量人的胎兒期神經(jīng)干細(xì)胞的報(bào)道。因?yàn)槿说臉颖举Y源較難獲取，胎兒的孕期時(shí)間隨機(jī)不可控，樣本質(zhì)量會(huì)受到流產(chǎn)藥物的影響，所以，在非人靈長類動(dòng)物上進(jìn)行胎兒期NSC分離培養(yǎng)可提升NSC的基礎(chǔ)和臨床轉(zhuǎn)化研究。

發(fā)明內(nèi)容

為了提高胎猴神經(jīng)干細(xì)胞的獲取效率、分化干性和傳代穩(wěn)定性，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)基及其在胎猴神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種培養(yǎng)基，其基底培養(yǎng)基是DMEM/F12，此外還含有1％?L-谷氨酰胺(L-glutamine)、2％?B27無血清添加劑(不含維生素A)、5-20ng/mL?bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)、5-20ng/ml?EGF(表皮細(xì)胞生長因子)、5-10μg/mL肝素、0.2mM?NEAA(非必需氨基酸)、1.5μg/mL?CHIR99021、10ng/mL?hLIF(人白血病抑制因子)、0.1mM維C、抗生素適量；

所述的抗生素優(yōu)選青霉素和鏈霉素；

所述的培養(yǎng)基可用于胎猴神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

胎猴神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

A、取孕期70-90天的母猴，此時(shí)胎猴腦形成完整結(jié)構(gòu)，體積增大又不至于過于成熟，且神經(jīng)干細(xì)胞較多，干性較好，并可以得到較多組織；剖腹產(chǎn)獲取胎猴，在無菌環(huán)境中分離胎猴的腦組織，然后剪碎為小組織塊，消化分離細(xì)胞；

步驟A所述的消化分離細(xì)胞包括以下步驟：

(1)將胎猴腦小組織塊用含雙抗的DPBS(無鈣鎂磷酸鹽緩沖液)清洗若干次，去掉血清和凍存液中的DMSO(二甲基亞砜)；

(2)將小組織塊剪碎，加入37℃水浴的Accutase酶和DNA酶，置于37℃消化20-30分鐘；