[發(fā)明專利]淡水水體細菌膦酸酯代謝關鍵基因（phnJ）的檢測引物、試劑盒及定量方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310037611.2
• 申請日: 2023-01-09
• 公開（公告）號: CN115927574A
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設計）人: 趙亮;李春連;曾瑩;朱家輝;賈璞;束文圣
• 申請（專利權）人: 華南師范大學
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 保定運維知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 13133
• 代理人: 侯喬瀚

1.一種淡水水體細菌膦酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

上游引物1:5’-GACGAACAGACCAARCGCATGAT-3’；

上游引物2:5’-ATGCCSATGCCYTATGGSTGGGG-3’；

上游引物3:5’-CCCTATGGYTGGGGCAC-3’；

下游引物1:5’-GGTGACGGGTCTGGATCAC-3’；

下游引物2:5’-CGACCTTSACCGGRTAGGC-3’；

下游引物3:5’-GGATCGGCACCTGRTAGAC-3’。

2.一種淡水水體細菌膦酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的檢測試劑盒，包括GreenProTaq?HS?Premix、陽性標準品和檢測引物，其特征在于，所述的陽性標準表為含有如SEQID?NO.7、SEQ?ID?NO.8與SEQ?ID?NO.9所示序列的重組質粒DNA序列，所述的檢測引物為權利要求1所述的檢測引物。

3.一種淡水水體細菌膦酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：提取待測樣品的基因組DNA作為模板，根據(jù)實驗需求加入權利要求1所述的檢測引物，與Green?ProTaq?HS?Premix混合形成擴增反應體系，進行熒光定量PCR反應，反應結束后，根據(jù)擴增曲線判斷待測樣品中酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的豐度。

4.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的根據(jù)擴增曲線判斷待測樣品中酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的豐度為：如果擴增曲線有典型熒光擴增曲線，且CT值小于30，則說明待測樣品中膦酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的豐度不低于10³，膦酸酯代謝關鍵基因(phnJ)的豐度低于10³。

5.根據(jù)權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的擴增反應體系為：每20μL包括以下組分：權利要求1所述的5μM對應引物對各1μL、Green?ProTaq?HS?Premix?10μL、模板DNA?1μL、ROX染料0.08μM，并用超純水補至20μL；所述的熒光定量PCR反應，其反應條件為：95℃預變性60s；95℃變性15s，63℃退火30s，72℃延伸30s，收集熒光信號強度，重復40個循環(huán)。