[發(fā)明專利]基于時珍法鑒定鹿科動物的物種特異性靶標序列、試劑盒及應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310030583.1
• 申請日: 2023-01-10
• 公開（公告）號: CN116083602B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋經(jīng)元;甘雨桐;許文杰;郝利軍;齊桂紅;辛天怡
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12N15/11;C12Q1/686;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京信慧永光知識產(chǎn)權(quán)代理有限責任公司 11290
• 代理人: 董世豪;張淑珍

1.鹿科動物的物種特異性靶標核苷酸，其中，所述靶標核苷酸選自：(1)以SEQ?ID?NO：7示出的靶標核苷酸；(2)以SEQ?ID?NO：8示出的靶標核苷酸；或(3)以SEQ?ID?NO：9示出的靶標核苷酸。

2.權(quán)利要求1所述的靶標核苷酸在對鹿科動物或源自鹿科動物的材料進行物種鑒定、或者區(qū)分鹿科動物與其近緣物種中的應用；

優(yōu)選地，所述鹿科動物選自馬鹿、梅花鹿和馴鹿。

3.一種用于對鹿科動物或源自鹿科動物的材料進行物種鑒定的引物對，包括：

(1)Ce_F：5’-CTACTCCAACCTATTGCAGA-3’(SEQ?ID?NO：1)，和Ce_R：5’-TTTGTGGAGGGATGCTTGAT-3’(SEQ?ID?NO：2)；或者

(2)Cn_F：5’-TACAGCTTTCTACTCAACAC-3’(SEQ?ID?NO：3)，和Cn_R：5’-CCACAGTTATGTGTGAGCAT-3’(SEQ?ID?NO：4)。

4.如權(quán)利要求3所述的引物對，其中，所述鹿科動物選自馬鹿、梅花鹿和馴鹿。

5.一種用于對鹿科動物或源自鹿科動物的材料進行物種鑒定的試劑盒，其中，所述試劑盒包含權(quán)利要求3或4所述的引物對。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中，所述試劑盒還包含：PCR反應試劑和CRISPR/Cas12a體系反應試劑；

優(yōu)選地，所述PCR反應試劑包含：PCR擴增緩沖液、dNTPs、Taq?DNA聚合酶、MgCl₂以及無菌超純水；

或者優(yōu)選地，所述CRISPR/Cas12a體系反應試劑包含：基因編輯緩沖液、Cas蛋白、crRNA、無核酸酶水和熒光信號分子；更優(yōu)選地，所述crRNA為以SEQ?ID?NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。

7.權(quán)利要求3或4所述的引物對或權(quán)利要求5或6所述的試劑盒在如下方面的應用：鑒定待檢測樣品中的鹿科動物成分，對鹿科動物或源自鹿科動物的材料進行物種鑒定，區(qū)分源自鹿科動物的中藥材與其混偽品，或者用于食品、藥品或保健品的安全檢測。

8.如權(quán)利要求7所述的應用，其中，所述待檢測樣品是鹿科動物、鹿科動物的組織或器官、含有鹿科動物的中藥材、或者鹿科動物混偽品；

優(yōu)選地，所述待檢測樣品是來自梅花鹿、馬鹿或馴鹿的樣品；

優(yōu)選地，所述待檢測樣品是單一物種來源的樣品或者是多個物種來源的樣品的混合物。

9.一種基于時珍法的鹿科動物鑒定方法，包括：

(1)獲取包括待鑒定物種在內(nèi)的全部鹿科動物各自的全基因組序列，構(gòu)建包括所述待鑒定物種在內(nèi)的全部鹿科動物各自的片段序列庫；

(2)按如下條件中的至少一種，對所述片段序列庫中的序列進行篩選，獲得全部鹿科動物各自的候選片段序列庫：(i)候選序列GC含量為40％-60％；(ii)候選序列不能含有連續(xù)4連以上的重復堿基、連續(xù)的3連重復堿基、3個以上的3連重復堿基；(iii)候選序列不能與crRNA重復序列互補；(iv)候選序列5'端6個堿基GC含量為30％-80％；以及(v)候選序列所在區(qū)域-50bp到+300bp或-300bp到+50bp內(nèi)不存在連續(xù)4個以上的A或GT重復；

(3)將所述待鑒定物種的候選片段序列庫與所述待鑒定物種的所有已知的基因組序列進行比對，從所述待鑒定物種的候選片段序列庫中篩選出與所述待鑒定物種的所有已知的基因組序列完全匹配的序列，構(gòu)建所述待鑒定物種的候選靶標序列庫；

(4)將所述待鑒定物種的候選靶標序列庫中的每一條序列在除所述待鑒定物種之外的全部鹿科動物各自的候選片段序列庫中進行比對，篩選出與除所述待鑒定物種之外的其他鹿科動物存在3個以上堿基錯配的一條或多條序列作為特異性靶標序列；

(5)基于所述特異性靶標序列設(shè)計引物對，提取待檢測樣品的基因組DNA并使用所述引物對進行擴增，對擴增產(chǎn)物進行檢測，檢測到相應的擴增產(chǎn)物時，則所述待檢測樣品與待鑒定物種具有同一性。

10.如權(quán)利要求9所述的鹿科動物鑒定方法，其中，將所述鹿科動物的全基因組序列分別用Jellyfish分成“L-S+1”個長度為S的片段，對每個片段檢測以選擇5'端帶有TTTV或3'端帶有VAAA的PAM基序的序列，并提取帶有PAM基序的序列構(gòu)建包括所述待鑒定物種在內(nèi)的全部鹿科動物各自的片段序列庫；其中，L＝全基因組序列長度，S＝24-26bp；

優(yōu)選地，所述crRNA重復序列為以SEQ?ID?NO：10示出的核苷酸序列；

優(yōu)選地，所述引物對包括：以SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2示出的引物對；以SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4示出的引物對；或者以SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6示出的引物對；

優(yōu)選地，所述擴增選自PCR擴增、或恒溫擴增；

優(yōu)選地，采用基因編輯對擴增產(chǎn)物進行檢測；

優(yōu)選地，采用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)進行所述基因編輯；

優(yōu)選地，所述CRISPR/Cas12a系統(tǒng)包括以SEQ?ID?NOs：11-13示出的crRNA中的任一者。