[發(fā)明專利]協(xié)氧蛋白FHb及其重組菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb1和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310030539.0
• 申請(qǐng)日: 2023-01-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115948427A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牟海津;辜自強(qiáng);于子涵;保智;牛飛宇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/31
• 分類號(hào): C12N15/31;C07K14/805;C12N15/81;C12N9/88;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 杜嬌

本發(fā)明涉及一種協(xié)氧蛋白FHb及其重組菌X33?pPICZαA?102C300C?FHb1和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，協(xié)氧蛋白FHb的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?N0.1所示。本發(fā)明還提供所述協(xié)氧蛋白FHb的氨基酸序列如SEQ?ID?N0.2所示。本發(fā)明還提供包括褐藻膠裂解酶基因和所述協(xié)氧蛋白FHb的基因的重組表達(dá)載體及重組菌X33?pPICZαA?102C300C?FHb1，所述重組工程菌提高了菌體在發(fā)酵后期低氧環(huán)境中對(duì)氧氣的利用率，最終提高了褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種協(xié)氧蛋白FHb及其重組菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb1和應(yīng)用。

背景技術(shù)

畢赤酵母是繼大腸桿菌之后最常用的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，目前它廣泛用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)制備、表征和結(jié)構(gòu)分析。在生物藥物領(lǐng)域，可通過(guò)畢赤酵母表達(dá)生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)，例如胰島素、乙型肝炎表面抗原、人血清白蛋白和表皮生長(zhǎng)因子等。與大腸桿菌和枯草芽孢表達(dá)系統(tǒng)相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如可以實(shí)現(xiàn)有效的分泌表達(dá)，減少后期分離和純化目標(biāo)蛋白所需的工作量，外源基因整合到基因組中可穩(wěn)定表達(dá)以及簡(jiǎn)便廉價(jià)的高密度生物質(zhì)積累。

畢赤酵母X33屬于野生型菌株，可以快速利用甲醇，將重組載體整合到菌株基因組上，結(jié)合載體上的醇氧化酶啟動(dòng)子(AOX),控制外源蛋白在宿主中的表達(dá)。當(dāng)前，在發(fā)酵過(guò)程中，由于畢赤酵母為高好氧微生物,常常會(huì)因?yàn)樵O(shè)備供氧能力有限，限制了細(xì)胞密度和氧化降解甲醇的速率，從而限制其目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。

黃素血紅蛋白(Flavohemoglobin,FHb)是一類存在于細(xì)菌、酵母等單細(xì)胞生物中的血紅蛋白。它包含一個(gè)n端血紅蛋白結(jié)構(gòu)域和一個(gè)c端氧化還原酶結(jié)構(gòu)域，它們具有NAD(P)H和FAD的潛在結(jié)合位點(diǎn)。FHb被認(rèn)為在O₂感應(yīng)、儲(chǔ)存和傳遞中發(fā)揮作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種協(xié)氧蛋白FHb及其重組工程菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb-1和應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)克隆協(xié)氧蛋白-黃素血紅蛋白基因FHb，構(gòu)建了產(chǎn)褐藻膠裂解酶的高表達(dá)菌株，提高了菌體在發(fā)酵后期低氧環(huán)境中對(duì)氧氣的利用率，最終提高了褐藻膠裂解酶的產(chǎn)量。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種協(xié)氧蛋白FHb的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?N0.1所示，所述協(xié)氧蛋白FHb的基因可用于提高畢赤酵母工程菌分泌褐藻膠裂解酶效率。

本發(fā)明還提供一種所述協(xié)氧蛋白FHb，其氨基酸序列如SEQ?ID?N0.2所示。

一種重組表達(dá)載體，所述載體含褐藻膠裂解酶基因和所述的協(xié)氧蛋白FHb的基因，所述褐藻膠裂解酶的核苷酸序列為SEQ?ID?N0.3所示。

一種重組菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb1，所述重組菌X33-pPICZαA-102C300C-FHb1包括所述重組表達(dá)載體；具體為將所述的協(xié)氧蛋白FHb的基因連接到褐藻膠裂解酶基因的末端，形成串聯(lián)表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供所述協(xié)氧蛋白FHb的基因在提高褐藻膠裂解酶分泌表達(dá)中的應(yīng)用，所述的褐藻膠裂解酶分泌表達(dá)為在真核表達(dá)系統(tǒng)中分泌表達(dá)；優(yōu)選為在畢赤酵母中分泌表達(dá)。

進(jìn)一步，所述的畢赤酵母菌優(yōu)選為畢赤酵母X33。

協(xié)氧蛋白FHb的基因的核苷酸序列：

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