[發明專利]一種羊病病毒多重PCR檢測引物、方法及應用

在審

• 申請號: 202310030468.4
• 申請日: 2023-01-10
• 公開（公告）號: CN116083653A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 潘永;楊莉;徐景峨;李婷;李剛;楊茂生;張亞楠;楊粵黔;唐遠江;孫啟躍;楊紅;邱垚;葉麗
• 申請（專利權）人: 貴州省畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶立信達知識產權代理有限公司 50286
• 代理人: 劉竹

1.一種羊病病毒多重PCR檢測引物，其特征在于，羊病病毒多重PCR檢測引物對中，羊口蹄疫病毒的引物FMDV-F的堿基序列為SEQ?ID?NO：1，FMDV-R的堿基序列為SEQ?ID?NO：2；羊口瘡病毒的引物ORFV-F的堿基序列為SEQ?ID?NO：3，ORFV-R的堿基序列為SEQ?ID?NO：4；山羊痘病毒的引物GTPV-F的堿基序列為SEQ?ID?NO：5，GTPV-R的堿基序列為SEQ?ID?NO：6。

2.一種實施如權利要求1所述羊病病毒多重PCR檢測引物的羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，羊病病毒多重PCR檢測方法包括以下步驟：

步驟一，進行核酸提取以及cDNA的反轉錄合成；

步驟二，進行多重PCR反應條件的優化；

步驟三，進行多重PCR特異性試驗和敏感性試驗；

步驟四，采用最佳的PCR反應條件進行臨床樣品檢測。

3.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟一中，提取待檢樣品組織中的病毒RNA或DNA，將RNA反轉錄為cDNA，利用多重PCR檢測引物對對病毒DNA和cDNA進行擴增；

采集病羊痂皮、水皰皮、水皰液或丘疹組織，將組織與生理鹽水按1：2的比例混合勻漿，使用離心柱型病毒DNA/RNA提取試劑盒抽提總核酸。

4.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟一中，病毒樣品和待檢臨床樣品核酸的提取均使用DNA/RNA提取試劑盒，DNA樣品保存于-20℃；將RNA樣品進行反轉錄，所獲得cDNA產物于-20℃保存，剩余RNA于-80℃保存。

5.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟一中，采用40μL反轉錄反應體系，利用HiScriptcDNA第一鏈合成試劑盒對RNA進行反轉錄；其中，RNA模板4μL，隨機引物2μL，2×RTMix20μL，HiScriptII?EnzymeMix4μL，RNase-freeddH₂O補足至總體積40μL；反轉錄反應程序為：25℃5mim，50℃15min，85℃2min。

6.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟二中，多重PCR反應為25μL體系；其中，2×AceTaqMasterMix12.5μL；FMDV-F和FMDV-R各0.5μL，濃度為10μmol/L；ORFV-F和ORFV-R各1μL，濃度為10μmol/L；GTPV-F和GTPV-R各0.5μL，濃度為10μmol/L；DNA/cDNA模板1.5μL；滅菌ddH₂O補足至總體積25μL；2×AceTaqMasterMix中溶質的濃度為10μmol/L。

7.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟二中，多重PCR擴增反應條件為：反應體系總體積為25μL；向多重PCR反應體系中加入提取獲得的組織病毒DNA或cDNA各1.5μL，并用滅菌ddH₂O補足至總體積25μL；多重PCR擴增反應程序為：95℃5min；95℃10s，57℃30s，72℃40s，共30個循環；72℃8min。

8.如權利要求2所述羊病病毒多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟三中，采用建立的多重PCR反應最佳條件，以FMDV、ORFV、GTPV、藍舌病病毒、小反芻獸疫病毒、魏氏梭菌、羊結核桿菌和山羊支原體樣品cDNA或DNA為模板，以無菌水為陰性對照，檢測多重PCR特異性；

在確定的最佳PCR反應條件下，分別測量并10倍稀釋三種病毒的DNA或cDNA，并以稀釋后的三種病毒的DNA或cDNA為模板，檢測PCR敏感性。

9.一種如權利要求1所述羊病病毒多重PCR檢測引物在制備羊口蹄疫病毒、羊口瘡病毒和山羊痘病毒的單一或混合感染檢測試劑盒中的應用。

10.如權利要求9所述羊病病毒多重PCR檢測引物在制備羊口蹄疫病毒、羊口瘡病毒和山羊痘病毒的單一或混合感染檢測試劑盒中的應用，其特征在于，通過將多重PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳試驗，觀察電泳圖是否出現與預期大小相符的目的條帶來判斷所檢測的樣本為單一還是混合感染；

其中，羊口蹄疫病毒預期條帶大小為544bp，羊口瘡病毒病毒預期條帶大小為361bp，山羊痘病毒預期條帶大小為222bp。