[發(fā)明專利]甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310027863.7
• 申請日: 2023-01-09
• 公開（公告）號: CN115902048A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成曉亮;周亞飛;李美娟
• 申請（專利權(quán)）人: 南京品生醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司;南京品生醫(yī)療科技有限公司;上海氨探生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 南京思拓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤;王海云

1.一種甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，

所述水溶性維生素分別為：維生素B7、維生素B9和煙酸；

上述水溶性維生素對應(yīng)的同位素內(nèi)標物分別為：維生素B7-d4、維生素B9-d4和煙酸-d4；

采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測經(jīng)過預(yù)處理的血清中的水溶性維生素，利用高效液相色譜將目標待測物與血清基質(zhì)中的干擾組分進行分離，再通過質(zhì)譜儀檢測目標待測物與其對應(yīng)同位素內(nèi)標的質(zhì)荷比的響應(yīng)，使用同位素內(nèi)標法定量，分別計算出3種水溶性維生素的含量，具體色譜條件為：

（1）高效液相色譜條件：

流動相A：0.01~0.5%甲酸水溶液；流動相B：甲醇；

色譜柱為：Agilent?EC?C18；

采用流動相A和流動相B為混合流動相進行梯度洗脫，所述梯度洗脫過程如下：在0-1.0分鐘內(nèi)，流動相A和流動相B的體積比由80:20勻速漸變至30:70；在1.0-2.5分鐘內(nèi)，流動相A和流動相B的體積比由30:70勻速漸變至2:98；在2.5-3.0分鐘內(nèi)，流動相A和流動相B的體積比為2:98；在3.0-3.1分鐘內(nèi)，流動相A和流動相B的體積比由2:98勻速漸變至80:20；在3.1-5.0分鐘內(nèi)，流動相A和流動相B的體積比為80:20；

（2）質(zhì)譜條件：

在電噴霧電離模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測進行正負切換掃描；毛細管電壓為3.5kV，噴嘴電壓為100?V；干燥氣溫度為300℃，鞘氣溫度為325℃，干燥氣流速為7?L/min，鞘氣流速為11?L/min，霧化氣壓力30?psi；同時監(jiān)測3種水溶性維生素及其對應(yīng)同位素內(nèi)標。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，其特征在于，所述經(jīng)過預(yù)處理的血清按照如下方法制備：向血清加入混合內(nèi)標工作液，渦旋后加入蛋白沉淀劑，振蕩離心后取上清液經(jīng)氮氣吹干，向其中加入衍生化試劑，在避光的條件下于40-80℃進行衍生反應(yīng)10-60?min，所得反應(yīng)液冷卻至室溫，加入氨水溶液進行中和，再次振蕩離心后，取上清液待進樣。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)沉淀劑為甲醇或乙腈；所述衍生化試劑為鹽酸與甲醇的混合溶液；所述氨水溶液為40~80%氨水溶液。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)沉淀劑為甲醇；所述衍生化試劑為體積比為1:4~10的鹽酸與甲醇的混合溶液；所述氨水溶液為50%氨水溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，其特征在于，所述衍生化試劑為體積比為1:9的鹽酸與甲醇的混合溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的甲基衍生化-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測血清中水溶性維生素的方法，其特征在于，所述經(jīng)過預(yù)處理的血清按照如下方法制備：取50?μL血清于1.5?mL離心管中，向其中加入20?μL混合內(nèi)標工作液，渦旋后，加入180?μL甲醇，振蕩后，在轉(zhuǎn)速為1400~15000?r/min，4℃的條件下離心4~10min；取150?μL上清液在37℃氮氣下吹干，向其中加入100?μL體積比為1:9的鹽酸與甲醇的混合溶液，渦旋混勻后，在避光的條件下于50℃進行衍生反應(yīng)20?min，所得反應(yīng)液冷卻至室溫，加入20?μL?50%氨水進行中和，再次振蕩后，在轉(zhuǎn)速為1400~15000?r/min，4℃的條件下離心1~5min，取上清液待進樣。