[發明專利]小鼠截短IL-36γ蛋白在制備免疫調節藥物中的應用

在審

• 申請號: 202310027587.4
• 申請日: 2020-11-16
• 公開（公告）號: CN116077625A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發明（設計）人: 朱俊豐;徐瑩;任蕾;劉姍姍
• 申請（專利權）人: 桂林醫學院附屬醫院
• 主分類號: A61K38/20
• 分類號: A61K38/20;C07K14/54;C12N15/24;C12N15/70;C07K1/22;A61P37/02;A61P1/00;A61P29/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京恒律知識產權代理有限公司 11416
• 代理人: 任霜

1.小鼠截短IL-36γ蛋白在制備免疫調節藥物中的應用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述免疫調節藥物包括調節炎癥性腸病的藥物。

3.小鼠截短IL-36γ蛋白在制備降低DSS誘導的腸炎易感性的藥物中的應用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的核苷酸序列；所述小鼠截短IL-36γ蛋白具有序列表SEQ.ID.No.2的氨基酸序列。

4.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述小鼠截短IL-36γ蛋白的制備方法為：

S1、構建pUC57-mIL-36γ質粒：合成小鼠截短IL-36γ蛋白基因，克隆入pUC57載體質粒，構建pUC57-mIL-36γ質粒；

S2、PCR擴增：以P1和P2為特異性引物，在引物的兩側導入NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點，以S1中得到的pUC57-mIL-36γ質粒為模板，進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；所述P1特異性引物具有序列表SEQ.ID.No.3的核苷酸序列；所述P2特異性引物具有序列表SEQ.ID.No.4的核苷酸序列；

S3、重組表達載體pET28a-mIL-36γ的構建：將pET28a載體質粒和S2中得到的PCR擴增產物分別均用NcoⅠ內切酶和XhoⅠ內切酶進行雙酶切，雙酶切后凝膠回收pET28a載體和IL-36γ，將回收后的pET28a載體與IL-36γ經T4連接酶定向連接，構建重組表達載體pET28a-mIL-36γ；

S4、轉化：將S3中得到的重組表達載體pET28a-mIL-36γ轉化大腸桿菌BL21，得到IL-36γ重組工程菌；

S5、小鼠截短IL-36γ蛋白的誘導表達：將S4中得到的IL-36γ重組工程菌接種于含卡那霉素的LB培養基中，在溫度為37℃、搖速為200r/min的條件下震蕩培養12h～14h后，以1:100的比例進行擴大培養，在溫度為37℃、搖速為210r/min的條件下震蕩培養3h，至OD600達到0.6時止，加入濃度為0.7mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶液，進行誘導表達，離心后，得到菌體；

S6、小鼠截短IL-36γ蛋白的純化：采用超聲破碎法將S5中得到的菌體進行超聲裂解后離心，取上清液；

S7、用Ni-NAT柱對S6中得到的上清液進行純化，得到小鼠截短IL-36γ蛋白。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S2中所述PCR擴增的反應體系為：2×PfuMasterMix25μL，P1特異性引物2μL、P2特異性引物2μL、pUC57-mIL-36γ質粒0.2μL，雙蒸水補足至50μL；所述PCR擴增的反應條件為：94℃預變性2min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，擴增30個循環；72℃延伸10min。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S5中所述LB培養基中的卡那霉素的濃度為50mg/L。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S5中所述誘導表達的條件為溫度為20℃，搖速為120r/min的條件下誘導20h。

8.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S5中離心的轉速為4000rpm～5000rpm，離心的時間為5min～10min；

S6中離心的轉速為8000rpm～10000rpm，離心的時間為10min～20min。

9.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S6中超聲裂解的反應條件為：在功率為150W～200W的條件下，超聲3s～5s，然后停止3s～5s，循環進行，共計進行45min～50min。

10.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，S7中純化的方法為：用濃度為50mmol/L的咪唑溶液洗脫雜蛋白，用濃度為200mmol/L的咪唑溶液洗脫截短IL-36γ蛋白。