[發明專利]一種酵母雜交啟動子及其應用

在審

• 申請號: 202310018450.2
• 申請日: 2023-01-06
• 公開（公告）號: CN116042621A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 諸葛斌;來潔;陸信曜;宗紅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N1/19;C12N15/65;C12N15/63;C12R1/84;C12R1/865;C12R1/72
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種酵母雜交啟動子及其應用，屬于基因工程技術領域。本發明以巴斯德畢赤酵母菌為表達宿主，通過將內源性組成型啟動子Ppgk1、Pssa1、Pgcw14、Peno1、Pkar2經過隨機雜交構建雜交啟動子文庫，結合高通量篩選策略，獲得發酵前期轉錄水平顯著提高的啟動子變體。在發酵12h、24h分別是常用組成型啟動子Pgap的2.86倍和1.97倍，為畢赤酵母的發酵和生產提供一個新型具有良好特征的啟動子，豐富了可供畢赤酵母使用的啟動子的種類。

技術領域

本發明公開了一種酵母雜交啟動子及其應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

巴斯德畢赤酵母(Komagataella?phaffii)作為一株甲基營養酵母菌株，因其獨特的優勢，如生物生長迅速、易于實現高密度發酵，低內源性蛋白質背景和強大的蛋白修飾折疊的能力等，被廣泛用于基礎研究的底盤微生物。隨著合成生物學的興起，畢赤酵母細胞工廠也已被廣泛用于重組蛋白、生物制藥以及高附加值化學品的工業生產等。

轉錄通常是基因表達的關鍵步驟。啟動子在轉錄水平上決定了基因的表達水平，可以說啟動子的活性高低在很大程度上影響著最終產物的表達水平。迄今，盡管在畢赤酵母里有大量野生型誘導型和組成型啟動子可用，但是由于甲醇的毒性、誘導劑的加入導致成本的增加以及運輸上的不安全，并且與誘導型啟動子相比，組成型啟動子通常可以簡化培養過程，使用組成性啟動子對于優化畢赤酵母細胞工廠更為有益。此外，在代謝工程和合成生物學中，尤其是代謝通路的構建往往會涉及到多個、跨越幾個數量級基因的表達，對于啟動子的常見改造，使用易錯PCR等完全非理性改造，會產生大量無效突變，而且只是針對“某個”啟動子的活性高低在變化。而根據不同啟動子的結構，對不同區域進行隨機雜交，既可以提高將不同功能特性糅合在同一啟動子上的可能性，也使獲得強啟動子的概率增加。目前對于化學品的生產工業和基因表達的微調需要不同性質的具有優良特征的啟動子。因此，基于啟動子的特點進行設計和構建具有階段特異性或不同特定強度的啟動子至關重要。

發明內容

本發明是通過對畢赤酵母內源性組成型啟動子Pkar2、Pssa1、Pgcw14、Ppgk1、Peno1雜交，將其連接到游離表達載體上，構建重組菌。以eGFP作為報告基因，得到雜交后的啟動子在12h、24h的熒光強度分別提高至對照啟動子Pgap的2.86倍和1.97倍，可極大地提高目的基因在發酵前期的表達水平。

本發明提供了一種啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明還提供了含有上述啟動子的重組載體。

在本發明的一種實施方式中，所述重組載體是以pGAP-pan-HIS4、pYX212、或pTGAP-GFP-TRP1t-panARS-URA5為表達載體。

本發明還提供了一種攜帶上述啟動子或上述重組載體的重組細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述重組細胞是以細菌或真菌為表達宿主。

在一種實施方式中，所述重組細胞的表達宿主包括但不現由于大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母。

本發明還提供了一種酵母基因工程菌，所述酵母基因工程菌是將含有上述啟動子、異源基因序列、終止子的表達框轉化到宿主細胞中得到的。

在本發明的一種實施方式中，所述酵母基因工程菌是以畢赤酵母、釀酒酵母或產甘油假絲酵母為宿主細胞。

在本發明的一種實施方式中，所述重組酵母工程菌以Komagataella?phaffii(Pichia?pastoris)GS115、S.cerevisiae?CEN.PK2-1C、產甘油假絲酵母CCTCC：M93018ΔURA5為表達宿主。