[發明專利]一種dsRNA在免疫缺陷中華蜜蜂模型構建中的應用

在審

• 申請號: 202310012287.9
• 申請日: 2023-01-05
• 公開（公告）號: CN116179608A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 鄭浩;張文昊
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;A01K67/033
• 代理公司: 昆明同聚專利代理有限公司 53214
• 代理人: 蘇蕓蕓

本發明公開了一種dsRNA的新用途，即其在免疫缺陷中華蜜蜂模型構建中的應用，dsRNA的核酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，本發明通過體外合成Spz4基因的部分片段的dsRNA，再給中華蜜蜂喂食dsRNA?72h后，即得免疫缺陷的中華蜜蜂模型，喂食dsRNA的免疫缺陷蜜蜂，Spz4基因的表達量降低70%，同時在致病菌侵染實驗中7天的死亡率相比野生型蜜蜂增加了60%以上；且在糞腸球菌感染24小時后，4種抗菌肽的表達量顯著降低。

技術領域

本發明屬于動物模型構建技術領域，具體的說，涉及一種dsRNA在免疫缺陷中華蜜蜂模型構建中的應用。

背景技術

免疫缺陷動物（immunodeficient?animal）是指由于先天性基因突變或使用人工方法而導致免疫系統一種或多種成分缺陷的動物，可以利用免疫缺陷型的中華蜜蜂模型，對研究致病菌，寄生蟲等致病機理有著極大的作用，從而可以達到有針對性的防治蜜蜂疾病的目的。

目前，在構建蜜蜂的免疫缺陷模型中，主要有兩種技術方法，分別是CRISPR/Cas9和RNAi的方法。CRISPR/Cas9可使基因功能喪失更徹底，但是其操作復雜，耗時長，成本高。RNAi方法不能使基因的功能完全喪失，但可以大幅度降低目標基因的表達，且操作簡單，耗時少，成本相對較低。RNAi是由雙鏈RNA（dsRNA）誘導內源性特異性基因轉錄后沉默的一種機制。dsRNA進入生物體后，在細胞中被Dicer酶的RNaseⅢ分解為21-23bp的小干擾RNA（siRNA）。siRNA在沉默復合物（RISC）的作用下與靶mRNA結合，從而使其降解，達到降低基因表達水平的目的。

發明內容

本發明提供了一種dsRNA的新用途，即其在免疫缺陷中華蜜蜂模型構建中的應用，dsRNA的核酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；本發明通過體外合成Spz4基因的部分片段的dsRNA，再給中華蜜蜂喂食dsRNA?72h后，即得到免疫缺陷的中華蜜蜂。

本發明采用RNAi的方法構建中華蜜蜂的免疫缺陷模型，RNAi的靶基因為Spaetzle4（Spz4，Gene?ID:?108002210），Spz4蛋白是Toll信號轉導途徑所必需的胞外蛋白，與Toll受體結合并激活通路，產生抗菌肽以抵抗病原體，因此我們通過RNAi沉默Spz4基因從而構建免疫缺陷的蜜蜂模型。

本發明免疫缺陷中華蜜蜂模型的構建方法如下步：

（1）提取中華蜜蜂的總RNA，反轉錄獲取cDNA；以cDNA作為模板，使用引物Spz4F：CAACGAATTCAGGGACGAGG，Spz4R：AGTAGTGCCGGGGAAATTCA進行PCR，獲得Spz4的第426-930位的基因片段；將Spz4基因片段與質粒載體pCE2連接后轉化入大腸桿菌DH5α中，篩選陽性克隆并提取質粒進行測序鑒定，將驗證陽性的含有pCE2-Spz4RNAi質粒的大腸桿菌DH5α接種于含有卡納霉素的LB液體培養基中進行增菌培養，抽提質粒，獲得pCE2-Spz4RNAi質粒；

（2）以pCE2-Spz4RNAi質粒為模板，采用如下引物進行PCR擴增，獲得用于擴增dsRNA序列的正向序列和反向序列，反應完成后進行瓊脂糖凝膠電泳，后回收電泳產物，以回收的電泳產物為模板，體外轉錄合成dsRNA；

Spz4F：CAACGAATTCAGGGACGAGG

T7+Spz4R：TAATACGACTCACTATAGGGAGTAGTGCCGGGGAAATTCA；

Spz4R：AGTAGTGCCGGGGAAATTCA

T7+Spz4F：TAATACGACTCACTATAGGGCAACGAATTCAGGGACGAGG；

（3）每日給中華蜜蜂喂食20μg的dsRNA，喂食72小時后，即得免疫缺陷型中華蜜蜂。