[發明專利]一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法

有效

• 申請號: 201610010474.3
• 申請日: 2016-01-08
• 公開（公告）號: CN105648109B
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 靳靜;李亞輝;黃德海;張改;李振江;陳松建;王書偉;王小亭;王山梅;楊朝寬
• 申請（專利權）人: 河南醫學高等專科學校
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/18;C12R1/92
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本發明屬于醫療衛生保健技術領域，具體涉及一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法。該方法具體包括制備雙層固體培養基、接種病菌和噬菌體、加入抗菌劑、觀察判定等步驟。本申請以部分特定菌株和噬菌體及部分廣譜性的抗菌劑為代表，對于噬菌體與化學抗菌劑聯用時的相互作用、相互影響進行了初步探討，所提供的噬菌體滅菌時的化學抗菌劑的篩選方法，為篩選獲得噬菌體與抗菌劑的最佳組合，以期獲得最佳抗菌效果提供了較好的技術保障。總體而言，本發明所提供的化學抗菌劑的篩選方法，操作簡單、結果穩定、可信度高，且容易觀察和判斷，因而在衛生保健領域具有較好地應用前景。

技術領域

本發明屬于醫療衛生保健技術領域，具體涉及一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法。

背景技術

化學抗菌劑通常包括用于體外的消毒劑（如環境消毒和生物體表皮膚黏膜消毒）和用于生物體內治療感染的天然抗生素或人工合成的抗菌藥物。在醫療衛生保健技術領域，為快速、有效控病菌感染，常需大量使用各種類型的化學抗菌劑進行滅菌處理。然而，隨著大量廣譜類抗菌劑的長期使用，細菌耐藥問題逐年加劇，一系列耐藥病原菌，如結核桿菌、金萄菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、腸球菌和銅綠假單胞菌等病原菌耐藥菌株的出現，引起公眾的廣泛關注，這也是人們意識到，尋找新的、更為環保和生態的抑制病原菌的用藥方式是解決細菌耐藥問題根本出路。

噬菌體是一種可以感染并裂解殺滅細菌的天然存在的病毒，最早由Twort和Herelle D兩人分別于1915年和1917年發現。由于其對人和動物無害，因此可將殺菌能力強的噬菌體用于自然環境和生物體內環境中的殺菌，以達到防治細菌感染體目的。由于噬菌體滅菌方式的環保性、高效性、特異性，因而使得人們近年對于噬菌體滅菌技術重新產生了濃厚的興趣。

在化學抗菌劑仍是控制細菌感染主流方法的背景下，采用噬菌體滅菌作為化學抗菌劑的補充具有十分重要的意義。但實際應用過程中，由于噬菌體種類繁多（自然界中超過10⁸種），化學抗菌劑的種類也很多，加之在應用噬菌體殺菌的環境中常常會有化學抗菌劑的殘留，而噬菌體與化學抗菌劑殺菌機制又完全不同，因而在噬菌體與化學抗菌劑聯合使用時，如何在種類繁多的噬菌體和化學抗菌劑中選擇出最佳的組合，是首先需要解決的關鍵問題。

發明內容

本發明目的是提供一種噬菌體滅菌時，篩選可以聯合使用的化學抗菌劑的方法，從而為噬菌體與化學抗菌劑的聯合應用提供可靠保障。

本發明所采取的詳細技術方案如下所述。

一種噬菌體滅菌時化學抗菌劑篩選方法，具體包括如下步驟：

（1）制備培養基，本發明中采用雙層固體培養基，具體為：

首先制備底層固體培養基，即加入1.5%的瓊脂粉的LB培養基，滅菌后，無菌環境下傾倒于無菌的9cm平皿中（10mL/平皿），制成固體培養基，凝固后置4℃保存待用，使用前置37℃下預熱；

其次制備頂層用半固體培養基，即加入0.5%的瓊脂粉的LB培養基，將培養基融化后分裝于玻璃試管中（3mL/管），加蓋滅菌后，趁熱置于45℃水浴中保溫以避免凝固；

（2）接種病菌和噬菌體，具體為，將100μL菌液（10⁹ CFU/ml）和100μL噬菌體懸液分別加入到步驟（1）中的半固體培養基中，混合均勻后，傾倒于步驟（1）中的固體培養基中，并鋪勻，室溫（20~25℃）凝固；

需要解釋的是，噬菌體懸液濃度以前期的預實驗結果為準，對于噬菌體懸液濃度進行控制主要是控制噬菌體在每個平皿中形成噬菌斑的數量，由于不同噬菌體所形成的噬菌斑的大小不同，因此噬菌體數量（噬菌體懸液濃度）并不是固定的，但以不會構成融合的最大噬菌斑數為最佳；

（3）加入抗菌劑，在步驟（2）中凝固后的雙層培養基中滴加5μL化學抗菌劑，培養約8~48h（培養時以所接種病菌的最適生長溫度為宜），觀察噬菌斑并進行判斷；