[發(fā)明專利]一種催化合成L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的高通量篩選方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211723747.0
• 申請(qǐng)日: 2022-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN115976157A
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾慶宇;程磊雨;溫俊婷;劉輝;陳劍波;姚浩楠;樓一緹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江新和成生物科技有限公司;上虞新和成生物化工有限公司;浙江新和成股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/48
• 分類號(hào): C12Q1/48;C12Q1/10;C12R1/19
• 代理公司: 杭州宇信聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33401
• 代理人: 梁群蘭

本發(fā)明涉及一種催化合成L?抗壞血酸?2?葡萄糖苷的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的高通量篩選方法，包括如下步驟：在待篩選菌株的培養(yǎng)體系中加入β?環(huán)糊精和抗壞血酸，調(diào)節(jié)pH至5.0?6.0進(jìn)行催化反應(yīng)；催化反應(yīng)之后去除菌株，加入氧化劑進(jìn)行氧化反應(yīng)；氧化反應(yīng)之后加入L?抗壞血酸?2?葡萄糖苷的顯色劑進(jìn)行顯色。本發(fā)明通過預(yù)氧化的策略，使未反應(yīng)的抗壞血酸得以去除，再加入能與L?抗壞血酸?2?葡萄糖苷顯色的物質(zhì)，在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)后可以方便地在酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，從而準(zhǔn)確定量反應(yīng)液體系中L?抗壞血酸?2?葡萄糖苷的含量，為高通量篩選突變菌株帶來便利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種催化合成L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的高通量篩選方法。

背景技術(shù)

目前L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷(AA-2G)合成中，世界領(lǐng)先的是日本企業(yè)“株式會(huì)社林原”，使用的酶為CGTase，即“環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶”，該酶在工業(yè)上大規(guī)模用于β-環(huán)糊精的合成。為了提高催化合成AA-2G的效率，有必要篩選具有更高活性的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶。對(duì)于該酶的篩選，通常使用的方法有“酚酞變色圈法”及“甲基橙法”。其基于的原理在于通過細(xì)菌產(chǎn)生CGTase酶把淀粉轉(zhuǎn)化成環(huán)糊精，利用環(huán)糊精包裹酚酞或甲基橙，使溶液褪色，來達(dá)到評(píng)價(jià)酶活性的目的。很顯然，這種方式并非直接評(píng)價(jià)AA-2G的合成活性，不能真實(shí)體現(xiàn)利用該酶來合成AA-2G的水平。

因此，如何獲得一種直接評(píng)價(jià)環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶催化合成AA-2G的活性的方法，將其應(yīng)用于高通量篩選，用于從飽和突變庫(kù)中快速、準(zhǔn)確地得到有益的突變菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于一種基于直接評(píng)價(jià)環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶催化合成L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷活性的高通量篩選方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明一方面涉及一種催化合成L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶的高通量篩選方法，包括如下步驟：

在待篩選菌株的培養(yǎng)體系中加入β-環(huán)糊精和抗壞血酸，調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0進(jìn)行催化反應(yīng)；

催化反應(yīng)之后去除菌株，加入氧化劑進(jìn)行氧化反應(yīng)；

氧化反應(yīng)之后加入L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的顯色劑進(jìn)行顯色。

本發(fā)明通過氧化反應(yīng)，使得未反應(yīng)的抗壞血酸被氧化，而L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷在此過程中未受到破壞，通過L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的顯色劑進(jìn)行顯色從而可以定量的檢測(cè)出L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的含量。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述β-環(huán)糊精和抗壞血酸的添加重量比為1：1-2。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述氧化劑為過氧化氫、臭氧、Fe³⁺鹽和空氣或氧氣的組合中的一種或者多種的組合；優(yōu)選地，所述氧化劑為過氧化氫，采用過氧化氫作為氧化劑，其氧化還原產(chǎn)物對(duì)于反應(yīng)體系的影響更小。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述顯色劑為磷鉬酸，加熱到70-90℃進(jìn)行顯色。AA-2G在顯色過程中被分解成抗壞血酸及葡萄糖，從而使磷鉬酸顯藍(lán)綠色，并且由于體系已經(jīng)不存在游離狀態(tài)的抗壞血酸，因此對(duì)該顯色過程不造成影響；而且，經(jīng)過驗(yàn)證葡萄糖本身不會(huì)對(duì)反應(yīng)體系造成干擾。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述顯色反應(yīng)之后通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，通過吸光度數(shù)據(jù)定量確定L-抗壞血酸-2-葡萄糖苷的含量。

本發(fā)明通過預(yù)氧化的策略，使未反應(yīng)的抗壞血酸得以去除，再加入能與AA-2G顯色的物質(zhì)，在一定條件下進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)后可以方便地在酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，從而準(zhǔn)確定量反應(yīng)液體系中AA-2G的含量，為高通量篩選突變菌株帶來便利。

附圖說明

圖1為0小時(shí)樣品譜圖；

圖2為反應(yīng)2.0小時(shí)后樣品譜圖；