[發明專利]一種可檢測多種毒力基因的高通量實時熒光定量PCR芯片及其檢測方法在審

申請號：	202211722466.3	申請日：	2022-12-30
公開（公告）號：	CN116287330A	公開（公告）日：	2023-06-23
發明（設計）人：	朱永官;謝舒婷;丁龍君;喬敏	申請（專利權）人：	中國科學院生態環境研究中心
主分類號：	C12Q1/689	分類號：	C12Q1/689;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/01;C12R1/22;C12R1/19;C12R1/42
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種檢測多種毒力基因通量實時熒光定量 pcr 芯片及其方法
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【說明書】：

本發明公開了一種可檢測多種毒力基因的高通量實時熒光定量PCR芯片及其檢測方法，所述方法含有能檢測微生物毒力基因的引物序列合集，如SEQ?ID?NO:1?240為所述目標毒力基因的引物序列，其中SEQ?ID?NO：1為上游引物，SEQ?ID?NO：2為對應的下游引物；SEQ?ID?NO：3為上游引物，SEQ?ID?NO：4為對應的下游引物；以此類推至SEQ?ID?NO:240。本發明針對4種典型人畜致病菌的96個毒力基因共設計了120對目標引物。應用該引物集于高通量qPCR平臺可實現在相同的擴增條件下一次性進行5184個定量PCR的毒力基因檢測，檢測效率得到提高，同時具有特異性好，靈敏度高，可重復性強的優點。降低檢測成本，可成功應用于環境樣品中的微生物毒力基因檢測研究。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種針對四種典型人畜致病菌的毒力基因的高通量qPCR芯片檢測方法。本發明還涉及該芯片在檢測特定微生物毒力基因中的應用。

背景技術

由于人畜共患病病原體在全球范圍內構成了重大的公共衛生風險，它們攜帶的毒力基因是環境中潛在風險的基礎。肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、大腸桿菌和腸道沙門氏菌被世界衛生組織列為重點關注的典型致病菌。毒素、細胞膜粘附、分泌系統、免疫規避/入侵和鐵吸收是毒力基因主要涉及的五種功能。然而，由于缺乏有效和可靠的量化工具，環境中的相關毒力基因的研究仍處于起步階段。

以往與細菌病原體所攜帶的毒力因子和毒力基因相關的研究主要是基于傳統的單基因PCR或定量PCR(qPCR)擴增，由于其技術限制，很難實現對各種毒力基因和大量樣本的快速檢測。另一方面，近年來，宏基因組學開始被應用于探索毒力因子的相關研究，但這種方法受到高測序成本和復雜耗時的數據處理和分析的限制，也很難驗證測序結果。而基于qPCR的方法更好地平衡了信息量和可行性，有助于各類環境樣品的快速準確檢測。HT-qPCR方法通過對目的基因進行定向擴增，具有成本更低和信息更豐富的潛在優勢。

發明內容

本發明的目的在于提供一種適用于研究環境中特定微生物的毒力基因的高通量定量PCR檢測方法。

為實現上述目的，本發明提供一種可并行檢測多種毒力基因的高通量實時熒光定量PCR引物，針對肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、致病性大腸桿菌和傷寒沙門氏菌這四種典型的人畜致病菌的毒力基因進行引物設計。

本發明提供一種可并行檢測多種毒力基因的熒光定量PCR引物組合物，所述組合物由下述120種引物對組成：

A1)由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A2)由SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A3)由SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A4)由SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A5)由SEQ?ID?No.9和SEQ?ID?No.10所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A6)由SEQ?ID?No.11和SEQ?ID?No.12所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A7)由SEQ?ID?No.13和SEQ?ID?No.14所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；

A8)由SEQ?ID?No.15和SEQ?ID?No.16所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對；