[發(fā)明專利]一種提高磷脂酶D合成PS活性的單點突變方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202211699856.3 | 申請日： | 2022-12-28 |
| 公開（公告）號： | CN116334032A | 公開（公告）日： | 2023-06-27 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 趙旭蕊;盧英華;林穎珺;方建華;林秀芬;趙坐都 | 申請（專利權(quán)）人： | 廈門藍(lán)灣科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/16 | 分類號： | C12N9/16;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/11;C12R1/19 |
| 代理公司： | 重慶萃智邦成專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50231 | 代理人： | 竺棟;文怡然 |
| 地址： | 361028 福建省*** | 國省代碼： | 福建;35 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 提高 磷脂酶 合成 ps 活性 單點 突變 方法 | ||
1.一種磷脂酶D的突變蛋白，對磷脂酶D的氨基酸序列進(jìn)行點突變，所述磷脂酶的氨基酸序列包括SEQ?ID?NO.1所示的序列；
所述突變的點位為：D175A、D175L、S451A、S451L、T194A、T194L、S457A、S457L、T194I、T194V、T194M、T194F、T194C或T194P。
2.一種表達(dá)權(quán)利要求1所述突變蛋白的重組菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組菌的基礎(chǔ)菌株包括大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3重組菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)培養(yǎng)野生型E.coli?TOP10/pBADKP-PLD2，其中載體為質(zhì)粒pBADKP，宿主細(xì)胞為E.coli?TOP10，具體構(gòu)建方法見專利CN109136207B；
(2)利用Plasmid?Mini?KitⅠ試劑盒從菌株E.coli?TOP10/pBADKP-PLD2中提取含有SEQID?NO.1所示氨基酸序列編碼基因的質(zhì)粒pBADKP，將質(zhì)粒pBADKP作為突變PCR的模板；
(3)利用定點突變引物對質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物；
(4)利用DpnⅠ酶消化擴增產(chǎn)物未突變的模板DNA，得到消化產(chǎn)物；
(5)將消化產(chǎn)物用熱激發(fā)導(dǎo)入E.coli?top10感受態(tài)細(xì)胞，通過含有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行單克隆的篩選，得到所述重組菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所述的定點突變引物包括：針對D175A點突的突變引物D175A-F和D175A-R，所述D175A-F的核苷酸序列如包括SEQ?IDNO.2所示，所述D175A-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；
針對D175L點突的突變引物D175L-F和D175L-R，所述D175L-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.4所示，所述D175L-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示；
針對D451A點突的突變引物D451A-F和D175A-R，所述D451A-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.6所示，所述D451A-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示；
針對D451L點突的突變引物D451L-F和D175L-R，所述D451L-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.8所示，所述D451L-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示；
針對T194A點突的突變引物T194A-F和D175A-R，所述T194A-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.10所示，所述T194A-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.11所示；
針對T194L點突的突變引物T194L-F和D175L-R，所述T194L-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.12所示，所述T194L-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.13所示；
針對D457A點突的突變引物D457A-F和D175A-R，所述D457A-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.14所示，所述D457A-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.15所示；
針對D457L點突的突變引物D457L-F和D175L-R，所述D457L-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.16所示，所述D457L-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17所示；
針對T194I點突的突變引物T194I-F和D175A-R，所述T194I-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.18所示，所述T194I-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.19所示；
針對T194V點突的突變引物T194V-F和D175A-R，所述T194V-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.20所示，所述T194V-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.21所示；
針對T194M點突的突變引物T194M-F和D175A-R，所述T194M-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.22所示，所述T194M-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.23所示；
針對T194F點突的突變引物T194F-F和D175A-R，所述T194F-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.24所示，所述T194F-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.25所示；
針對T194C點突的突變引物T194C-F和D175A-R，所述T194C-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.26所示，所述T194C-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.27所示；
針對T194P點突的突變引物T194P-F和D175A-R，所述T194P-F的核苷酸序列如包括SEQID?NO.28所示，所述T194P-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.29所示。
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