[發明專利]賴氨酰特異性內切酶突變體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202211681726.7
• 申請日: 2022-12-27
• 公開（公告）號: CN115717137A
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 曹海燕;張世野;曹丙洲
• 申請（專利權）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12N15/57;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 董亞男

本發明涉及基因工程技術領域，具體講，涉及一種賴氨酰特異性內切酶突變體及其制備方法和應用。本發明的賴氨酰特異性內切酶突變體是將野生型賴氨酰特異性內切酶中第51位和/或第137位的氨基酸進行如下突變得到的：Y51D突變、R137K突變。相比其野生型賴氨酰特異性內切酶，本發明的突變體具備顯著提高的酶活和酶活穩定性。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體講，涉及一種賴氨酰特異性內切酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

賴氨酰特異性內切酶（Lysyl endopeptidase,EC 3.4.21.50）又稱賴氨酰肽鏈內切酶、無色桿菌蛋白酶I、賴氨酸內肽酶、賴氨酰內切酶、賴氨酸C端內切酶、Lys-C內切酶，是一種絲氨酸蛋白酶，最初由Masaki等人從土壤細菌中發現并分離得到的。賴氨酰肽鏈內切酶具有高度特異性，可特異性切割肽鏈中賴氨酸殘基和S-氨乙基半胱氨酸殘基羧基端的肽鍵。

賴氨酰特異性內切酶是一條由268個氨基酸殘基構成的多肽，其中肽鏈內部含有三個二硫鍵（Cys6-Cys216，Cys12-Cys80，Cys36-Cys58），由His57、Asp113和Ser194構成的三聯體決定了該酶的催化活性，而Asp225決定了其對賴氨酸的特異選擇性。

賴氨酰特異性內切酶與牛胰蛋白酶的氨基酸序列雖然只有20％的同源性，但是決定酶催化活性以及賴氨酸特異性相關的氨基酸序列和空間結構完全一致，因此賴氨酰特異性內切酶被歸為胰蛋白酶家族。與牛胰蛋白酶相比，賴氨酰特異性內切酶對賴氨酸碳端的選擇性更高，并且有10倍于胰蛋白酶的活性、較廣的最適pH范圍（pH 8.5～10.5）及在4 M的尿素或0.1％的SDS中依然正常的穩定性。這些特性使賴氨酰特異性內切酶成為生物醫藥生產中一種非常有用的工具酶。

利用天然無色桿菌Achromobacter lyticus M497-1生產的賴氨酰內切酶表達量低，周期長，成本明顯較高，導致賴氨酰內切酶價格居高不下。而大腸桿菌Escherichiacoli是目前應用最廣泛的蛋白表達系統，大腸桿菌表達系統具有遺傳背景和生理特性研究清楚，已開發有多種商業化工程菌可以使用；且大腸桿菌易于培養和控制、轉化操作簡單，并具有表達水平高、成本低、周期短等特點。

但由于賴氨酰特異性內切酶自身氨基酸序列和結構特點，對于目前廣泛應用的大腸桿菌表達系統獲得的其包涵體存在著酶活降低、穩定性不足等問題。因此，仍需要能夠更優的適應大腸桿菌表達系統，并具備更高酶活及酶活穩定性的賴氨酰特異性內切酶。鑒于此，特提出本發明。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明通過大量的研究，提供了一種賴氨酰特異性內切酶突變體、其重組基因工程菌及構建方法，本發明的賴氨酰特異性內切酶突變體具備顯著提高的酶活和酶活穩定性。

本發明的第一方面提出了一種賴氨酰特異性內切酶突變體，是將野生型賴氨酰特異性內切酶中第51位和/或第137位的氨基酸進行如下突變得到的：Y51D突變和R137K突變。所述野生型賴氨酰特異性內切酶的氨基酸序列為Genbank中Sequence ID: 1ARB_A所示，具體為：

GVSGSCNIDVVCPEGDGRRDIIRAVGAYSKSGTLACTGSLVNNTANDRKMYFLTAHHCGMGTASTAASIVVYWNYQNSTCRAPNTPASGANGDGSMSQTQSGSTVKATYATSDFTLLELNNAANPAFNLFWAGWDRRDQNYPGAIAIHHPNVAEKRISNSTSPTSFVAWGGGAGTTHLNVQWQPSGGVTEPGSSGSPIYSPEKRVLGQLHGGPSSCSATGTNRSDQYGRVFTSWTGGGAAASRLSDWLDPASTGAQFIDGLDSGGGTP。

本發明對賴氨酰特異性內切酶序列進行了深入的研究分析，篩選了數十個突變點及其組合，最終得到本發明的Y51D突變、R137K突變及其組合。上述突變體可改善蛋白的體外復性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特異性和活性，并可顯著提高蛋白酶的酶活和酶活穩定性。