[發(fā)明專(zhuān)利]基于“Cu(II)to Cu(II)”機(jī)理的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)日: 2022-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116087308A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡宇芳;劉佳月;盧彥美
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N27/48
• 分類(lèi)號(hào): G01N27/48;G01N27/30;G01N27/327
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明是一種基于“Cu(II)to?Cu(II)”機(jī)理的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用，首先CoA中的巰基與Cu(II)原位產(chǎn)生CoA?Cu(II)復(fù)合物，可以視作具有多個(gè)腺嘌呤作為側(cè)基的納米鏈狀復(fù)合物，該復(fù)合物可以通過(guò)其腺嘌呤側(cè)基與GO通過(guò)π?π共軛效應(yīng)結(jié)合，從而結(jié)合固定在電極表面，利用FSCV技術(shù)采集Cu(II)的電壓信號(hào)，因?yàn)镃oA與Cu(II)的聚合作用可實(shí)現(xiàn)CoA的電化學(xué)傳感分析，又因?yàn)镃oA是HAT催化反應(yīng)的產(chǎn)物可實(shí)現(xiàn)HAT的電化學(xué)傳感分析，改變CoA或是HAT濃度，可以獲得一系列不同濃度CoA與HAT對(duì)應(yīng)的FSCV信號(hào)大小；加入抑制劑漆樹(shù)酸/C646時(shí)，HAT活性被抑制，無(wú)法生成CoA，使得復(fù)合物無(wú)法形成，從而實(shí)現(xiàn)HAT抑制劑的篩選?；诖藰?gòu)建了一種快速、簡(jiǎn)單、可靠穩(wěn)定、靈敏度高的FSCV分析方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種特殊的“Cu(II)to?Cu(II)”機(jī)理，尤其是涉及基于輔酶A-銅離子復(fù)合物的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)傳感器的制備及其在輔酶A、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶在分析傳感中的應(yīng)用，屬于功能生物材料和生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

組蛋白乙酰化是在真核生物基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的重要修飾過(guò)程，受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)調(diào)控，主要通過(guò)改變組蛋白乙酰標(biāo)記在局部染色質(zhì)區(qū)域的分布從而影響局部染色質(zhì)松弛狀態(tài)，來(lái)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄激活，HAT是可以催化組蛋白中發(fā)生乙?；囊活?lèi)酶，作為乙?；w的乙酰輔酶A(Ac-CoA)，乙?；鶑腁c-CoA轉(zhuǎn)移到底物肽的特定賴(lài)氨基殘基上，調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)和調(diào)控基因的表達(dá)。一旦細(xì)胞內(nèi)乙?；?去乙酰化之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，就會(huì)導(dǎo)致各種疾病，如帕金森氏病、白血病，甚至癌癥。轉(zhuǎn)錄輔激活物p300是一種最常見(jiàn)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)乙?；旧|(zhì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，其介導(dǎo)著許多細(xì)胞生理活動(dòng)過(guò)程，如DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞分化與凋亡等。因此，檢測(cè)HAT?p300的活性對(duì)于研究相關(guān)生物學(xué)過(guò)程和疾病發(fā)生的發(fā)展有著很重要的研究意義。

目前，已經(jīng)有很多方法來(lái)檢測(cè)HAT?p300的活性，比如熒光、電化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)等，其中電化學(xué)方法因?yàn)槠涓哽`敏度、低成本、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作便捷、小型化可能等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注，但是傳統(tǒng)的電化學(xué)方法穩(wěn)定性和靈敏度有限，針對(duì)這兩個(gè)問(wèn)題，本課題組將電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)與信息工程技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行改裝設(shè)計(jì)構(gòu)建了一套快速掃描裝置，其中最經(jīng)典的快速掃描循環(huán)伏安法(FSCV)作為循環(huán)伏安法(CV)的一種變體，是用高掃描速度完成特定部位神經(jīng)遞質(zhì)和痕量的檢測(cè)呈現(xiàn)的電化學(xué)方法，能夠有效提高檢測(cè)靈敏度、增加分析結(jié)果的可靠性。FSCV作為一種功能強(qiáng)大的電化學(xué)分析技術(shù)，最常見(jiàn)的方法是將特別設(shè)計(jì)的恒電位儀與電極結(jié)合，將施加的電勢(shì)以高掃描速度進(jìn)行掃描，產(chǎn)生亞秒級(jí)的時(shí)間分辨率和亞微米級(jí)的空間分辨率。目前，F(xiàn)SCV方法僅僅應(yīng)用于小分子物質(zhì)(如金屬離子、多巴胺等)的檢測(cè)，但是對(duì)于大分子尤其是生物大分子的檢測(cè)出現(xiàn)“空白”現(xiàn)象，最重要的原因是在生物大分子能夠給系統(tǒng)帶來(lái)較大的背景信號(hào)，沒(méi)有辦法實(shí)現(xiàn)直接檢測(cè)，因此，在生物化學(xué)領(lǐng)域，F(xiàn)CSV方法的廣泛使用仍然是一個(gè)亟待解決的大課題。

對(duì)于經(jīng)典電化學(xué)，金屬離子二價(jià)銅(Cu(II))由于其本身的氧化還原活性在低掃速條件下發(fā)生“Cu(II)to?Cu(0)”轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)極不穩(wěn)定，且靈敏度受到影響。針對(duì)此，本發(fā)明基于快速掃描循環(huán)伏安提出了“Cu(II)to?Cu(II)”機(jī)理，基于CoA(含1個(gè)巰基)與Cu(II)的結(jié)合作用，利用CoA上的腺嘌呤結(jié)構(gòu)與石墨烯二維材料(GO)的共軛作用制作電化學(xué)基底，通過(guò)Cu(II)的連續(xù)電壓信號(hào)輸出實(shí)現(xiàn)CoA生物小分子檢測(cè)；由于CoA是HAT?p300催化反應(yīng)的產(chǎn)物，該傳感方法可以用于間接地檢測(cè)HAT?p300活性及其小分子抑制劑的篩選，從而避免了生物大分子對(duì)背景信號(hào)的影響。目前尚未見(jiàn)聯(lián)合電化學(xué)快速掃描技術(shù)、“Cu(II)to?Cu(II)”機(jī)理、CoA-Cu(II)復(fù)合物檢測(cè)CoA、HAT?p300的電化學(xué)傳感器，該方法具有較低的靈敏度，較好的信號(hào)穩(wěn)定性，并具有較好的新穎性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好、檢測(cè)速度快、成本低廉的基于“Cu(II)to?Cu(II)”機(jī)理的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶電化學(xué)傳感器的制備及應(yīng)用。