[發(fā)明專利]一種APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211661505.3
• 申請日: 2022-12-23
• 公開（公告）號: CN116024270A
• 公開（公告）日: 2023-04-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭萍;姚永剛;畢蕊;李聰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院昆明動物研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/65;C12N15/12;C12N15/57;A01K67/027
• 代理公司: 昆明科眾知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53218
• 代理人: 方金敏

1.一種APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：用慢病毒攜帶致病基因APP和PSEN1感染樹鼩精原干細胞，獲得轉(zhuǎn)AD基因樹鼩精原干細胞，將轉(zhuǎn)AD基因樹鼩精原干細胞注射到經(jīng)白消安處理的雄性樹鼩睪丸中，再讓受體雄性樹鼩與野生型雌性樹鼩交配，對獲得的子代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩進行鑒定，獲得產(chǎn)生過表達突變型APP和PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：所述的轉(zhuǎn)AD基因樹鼩精原干細胞獲得包括以下步驟：

S1慢病毒制備將含有致病變異的家族型阿爾茨海默病的最主要的致病基因APP和PSEN1通過XbaI和NotI酶切位點，在EF1α啟動子后面插入含APP^K670N/M671LCDS區(qū)，在CMV啟動子后面插入PSEN1^M139V/M146L/H163RCDS區(qū)，建立APP和PSEN1基因的慢病毒載體，將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒psPAX、pMD2.G共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，分別在48h、72h收集病毒上清，超速離心濃縮獲得慢病毒；

S2病毒感染獲得轉(zhuǎn)AD基因樹鼩精原干細胞配制好的病毒液感染樹鼩精原干細胞，病毒感染后24小時，通過熒光顯微鏡觀察，成功整合APP^K670N/M671L基因的精原干細胞表達紅色熒光蛋白，成功整合PSEN1^M139V/M146L/H163R基因的精原干細胞表達綠色熒光蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：所述的雄性樹鼩是使用白消安腹腔給藥(35mg/kg)，去除樹鼩內(nèi)源生精細胞獲得的。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：所述的轉(zhuǎn)基因精原干細胞經(jīng)PBS重懸后注射到受體樹鼩曲細精管中，2個月后，使受體雄性樹鼩與野生型雌性樹鼩交配繁殖得到F1代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：所述的F1子代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩作為父本和母本進行交配，得到F2代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩，將得到的F2代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩作為父本和母本進行交配，得到F3代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩，繼續(xù)上述步驟交配5～10次，得到Fn代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的APP/PSEN1雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病樹鼩模型的建立方法，其特征在于：對獲得所述的F1至Fn代AD轉(zhuǎn)基因樹鼩進行鑒定，包括AD的分子、病理、行為學(xué)特征。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一權(quán)利要求得到的子代轉(zhuǎn)基因樹鼩的用途，其特征在于：所述的子代轉(zhuǎn)基因樹鼩用于研究AD致病機制、藥物研發(fā)和藥物篩選。