[發明專利]一種mRNA的加帽方法

在審

• 申請號: 202211659059.2
• 申請日: 2022-12-22
• 公開（公告）號: CN115948382A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 張松平;蘇志國;車詩怡;李正軍;林旋;馮雪
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12P19/34
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 陳小龍

本發明公開了一種mRNA加帽的方法。所述方法包括：將mRNA連接在固定相后進行加帽反應，得到加帽的mRNA。本發明創造性地建立了一種基于固定化mRNA的加帽反應?分離耦合策略，提供一種高效，簡便，低成本的加帽方法，加帽操作既可以間歇操作，也可以在柱子上連續操作，為mRNA新型生產工藝的開發及應用提供了研究基礎。

技術領域

本發明屬于核酸技術領域，涉及一種mRNA的加帽方法。

背景技術

天然mRNA具有單鏈結構，由5’端甲基鳥苷酸帽(5’-cap)、3’端多聚腺苷酸尾(3’-polyA)以及中間的蛋白翻譯區和非翻譯區組成。其中，5’-cap可以消除mRNA序列中的游離磷酸基團，防止核糖核酸酶和核酸外切酶對mRNA的消化，從而顯著提高mRNA的穩定性，同時，5’-cap能夠促進核糖體識別mRNA，并通過與真核翻譯起始因子4E(eIF4E)結合來提高翻譯效率。根據5’-cap中甲基化的程度，mRNA中存在三種類型的帽，即cap-0(m⁷GpppN)、cap-1(m⁷GpppNm)和cap-2(m⁷GpppNmNm)。免疫細胞中的模式識別受體(PRRs)可以識別未加帽的mRNA或具有cap-0帽的mRNA并抑制其翻譯。然而，具有cap-1和cap-2帽結構的mRNA在被識別后仍然被翻譯。當前治療用的mRNA均由體外轉錄獲得，即在RNA聚合酶的作用下，以DNA為模板轉錄生成mRNA。為了提高轉錄后mRNA的結構穩定性和翻譯效率，需進一步對其進行加帽。

目前mRNA的加帽方法包括酶法加帽、共轉錄法加帽、化學法加帽。其中最常用的是酶法加帽，即首先通過具有三種酶活性的牛痘病毒加帽酶產生cap-0帽，其具體的反應機制為：mRNA在RNA三磷酸酶的作用下脫去一個5’端的磷酸基團，之后鳥苷轉移酶將三磷酸鳥苷(GTP)分子中的單磷酸鳥苷(GMP)結構添加至脫去一個磷酸基團的mRNA上，最后通過鳥苷甲基轉移酶的催化在鳥嘌呤結構的N7端添加一個甲基，從而生成具有cap-0帽結構的mRNA。此外，在2-O’甲基轉移酶的作用下，具有cap-0帽結構的mRNA能夠在2-O’端添加一個甲基生成具有cap-1帽結構的mRNA。但酶法加帽法反應組分較多，需要經過“吸附-洗脫-加帽-再吸附-再洗脫”的五步操作才能夠獲得純化的加帽mRNA，分離步驟多，成本高，mRNA產量低，損失大，易降解。

WO2016193226A1公開了一種利用固定化加帽酶對RNA加帽的方法，所述方法中，牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基轉移酶的固定相均為環氧甲基丙烯酸磁珠，該固定相經過環氧基活化后能夠與酶分子的半胱氨酸形成巰基，從而進行兩種加帽酶的固定，其固定條件為：100mM磷酸鉀、500mM氯化鈉、1mM乙二胺四乙酸(pH7.5)，在20℃固定60min后，其上清液中的蛋白酶濃度經測定基本為0，說明該方法固定化加帽酶的效率較高。經過高效液相色譜柱進行分析，加帽酶在通過該方法固定化后具有較高的活性和穩定性。但該方法仍需要先利用介質把mRNA吸附-洗脫進行分離，然后與固定化的加帽酶結合進行加帽反應，后續仍需要把mRNA從除加帽酶之外的其他組分中分離出來，存在造成mRNA損失等問題。

CN112626177A公開了一種快速定量檢測RNA加帽效率的方法，所述方法步驟包括S1.體外轉錄合成未加帽的RNA并除去模板DNA；S2.對RNA進行加帽處理；S3.對經S1、S2步驟得到的RNA進行單磷酸化處理：先利用堿性磷酸酶去磷酸化，RNA純化后再利用多聚核苷酸激酶在RNA的5’端加上單磷酸；S4.用單磷酸酶除去進行單磷酸化處理后的RNA，并設置不用單磷酸酶處理的對照組；S5.跑膠檢測，定量測定用單磷酸酶處理的RNA的條帶亮度(記為n)以及對照組的RNA的條帶亮度(記為N)，計算RNA的加帽效率為：(n/N)×100％。該方法可快速定量地檢測出RNA的加帽效率，操作簡單快速，結果有效準確，對樣品需求量少，對RNA類型、長度等無特殊要求，適用范圍廣。但此方法存在加帽前后分離步驟多，純化容易造成mRNA的質量損失，工藝時間長，并容易導致mRNA的降解等問題。