[發明專利]使用谷氨酰胺合成酶基因內互補載體直接選擇表達高水平異聚蛋白的細胞

在審

• 申請號: 202211654230.0
• 申請日: 2017-05-11
• 公開（公告）號: CN115873904A
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: R.R.克徹姆;J.T.麥格魯;D.A.富米納亞林;T.P.蒙羅;N.J.阿格拉沃爾;K.M.達里斯
• 申請（專利權）人: 美國安進公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/67;C12N15/13;C12N5/10;C12N15/52;C12N15/53;C12N15/62
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 黃登高;彭昶

1.一種載體，其包含：

a) 第一核酸，所述第一核酸編碼第一多肽，以及

b) 第二核酸，所述第二核酸編碼第二多肽，其中所述第二多肽是選擇性標記的初始片段，

其中所述第一核酸的轉錄可操作地連接至所述第二核酸的轉錄，

所述載體還包含：

c) 第三核酸，所述第三核酸編碼第三多肽，其中所述第三多肽能夠與所述第一多肽締合以形成異聚復合物，以及

d) 第四核酸，所述第四核酸編碼第四多肽，其中所述第四多肽是所述選擇性標記的互補片段，

其中所述第三核酸的轉錄可操作地連接至所述第四核酸的轉錄，

其中所述選擇性標記的所述初始片段和所述互補片段相互作用以提供可選擇活性，并且進一步其中所述載體能夠轉染到哺乳動物細胞中并改進轉染的細胞的選擇。

2.如權利要求1所述的載體，其中所述異聚復合物是免疫球蛋白，任選地其中所述第一核酸編碼免疫球蛋白重鏈，并且所述第三核酸編碼免疫球蛋白輕鏈。

3.如權利要求1所述的載體，其中所述選擇性標記是選自以下的代謝酶：谷氨酰胺合成酶、精氨基琥珀酸裂解酶、腺苷酸基琥珀酸合成酶和谷氨酸脫氫酶。

4.如權利要求1所述的載體，其中內部核糖體進入位點(IRES)發生在選自以下的位點：

a) 在所述第一核酸與所述第二核酸之間的位點；

b) 在所述第三核酸與所述第四核酸之間的位點，以及

c) 在所述第一核酸與所述第二核酸之間、以及在所述第三核酸與所述第四核酸之間的位點，任選地其中所述內部核糖體進入位點包含SEQ ID NO:23。

5.如權利要求1所述的載體，其中所述選擇性標記的所述初始突變體亞基是谷氨酰胺合成酶的N-末端片段，并且所述選擇性標記的所述互補突變體亞基是谷氨酰胺合成酶的C-末端片段。

6.如權利要求5所述的載體，其中谷氨酰胺合成酶的所述N-末端片段和/或所述C-末端片段在谷氨酰胺合成酶的選自以下的氨基酸處斷裂：E110、Y104、S125、N126、E264、T111、N105、N126、Q127、和N265。

7.如權利要求6所述的載體，其還包含N-末端亮氨酸拉鏈或C-末端亮氨酸拉鏈。

8.一種分離的宿主細胞，其用如權利要求1-7中任一項所述的載體轉染、轉化或轉導，任選地其中所述細胞選自CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、骨髓瘤細胞系以及WI38細胞。

9.一種產生異聚復合物的方法，所述方法包括在由所述宿主細胞表達所述異聚復合物的條件下培養如權利要求8所述的宿主細胞的步驟，任選地其中所述異聚復合物是抗體。

10.如權利要求9所述的方法，其還包括分離所述異聚復合物。

11.一種表達系統，其包含：

a) 第一載體，所述第一載體編碼雙順反子轉錄物，所述第一載體包含編碼第一多肽的第一核酸，所述第一核酸可操作地連接至編碼第二多肽的第二核酸，其中所述第二多肽是選擇性標記的初始片段，以及

b) 第二載體，所述第二載體編碼雙順反子轉錄物，所述第二載體包含編碼第三多肽的第三核酸，所述第三核酸可操作地連接至編碼第四多肽的第四核酸，其中所述第四多肽是所述選擇性標記的互補片段，所述互補片段能夠與所述選擇性標記的所述初始片段締合以提供可選擇活性，進一步其中所述第三多肽能夠與所述第一多肽締合以形成異聚復合物；

并且進一步其中所述表達系統能夠轉染到哺乳動物細胞中并改進所述細胞的選擇。

12.如權利要求11所述的表達系統，其中所述異聚復合物是免疫球蛋白，任選地其中所述第一核酸編碼免疫球蛋白重鏈，并且所述第三核酸編碼免疫球蛋白輕鏈。