[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211646814.3
• 申請(qǐng)日: 2022-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115807131A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周?chē)?guó)華;單靖雯;武海萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/682;C12N15/11;C12R1/92
• 代理公司: 江蘇斐多律師事務(wù)所 32332
• 代理人: 張佳妮

本發(fā)明公開(kāi)一種用于RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)新方法，整個(gè)檢測(cè)包括三個(gè)部分：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(將靶RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA)、核酸擴(kuò)增反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)(將產(chǎn)物檢測(cè)轉(zhuǎn)化為核酸片段檢測(cè))及納米金探針雜交顯色反應(yīng)(將核酸片段檢測(cè)轉(zhuǎn)化為可視化檢測(cè))，通過(guò)控制溫度所有反應(yīng)可在單個(gè)封閉體系中依次進(jìn)行，無(wú)需其他額外操作，實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)，結(jié)果出”的核酸可視化檢測(cè)。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、具有高靈敏度和高特異性等特點(diǎn)，不依賴(lài)熒光檢測(cè)設(shè)備，可通過(guò)肉眼直接判讀結(jié)果，適用于多種病原體核酸的可視化檢測(cè)，在現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明專(zhuān)利涉及一種用于RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)方法，屬于核酸檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來(lái)，由RNA病毒感染所引起的流行性疾病給全球人類(lèi)健康帶來(lái)巨大危害。因此，很多基于核酸的病原體快速檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在流行性疾病的早期診斷和疫情防控中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(Polymerase Chain Reaction，PCR)作為核酸檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，主要采用TaqMan探針?lè)ɑ驘晒馊玖戏ㄟM(jìn)行檢測(cè)，該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，需要復(fù)雜的熒光讀取儀器，不利于在資源有限的地方推廣使用。而基于可視化的核酸檢測(cè)方法，無(wú)需借助昂貴的儀器，通過(guò)肉眼即可判讀結(jié)果，因此受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注。

用于即時(shí)檢測(cè)(POCT)的可視化檢測(cè)方法主要包括比色法和橫向流動(dòng)試紙條。基于pH敏感指示劑和金屬離子指示劑的比色法，在檢測(cè)較低的病毒載量時(shí)，陰陽(yáng)性結(jié)果的顏色差異不明顯，肉眼判讀難度大，容易出現(xiàn)結(jié)果誤判的情況；橫向流動(dòng)試紙條作為一種低成本、操作簡(jiǎn)便的紙基可視化檢測(cè)工具，雖然能給出一個(gè)明確的，肉眼易判讀的結(jié)果，但是其檢測(cè)對(duì)象為擴(kuò)增產(chǎn)物，極易造成嚴(yán)重的氣溶膠污染。而納米金具有獨(dú)特的光化學(xué)性質(zhì)，可作為可視化檢測(cè)的最佳材料，但是納米金雜交顯色反應(yīng)靈敏度低、特異性差無(wú)法用于臨床樣本的檢測(cè)。將納米金雜交顯色反應(yīng)與核酸擴(kuò)增反應(yīng)和核酸侵入反應(yīng)相偶聯(lián)，建立一種高靈敏、高特異、無(wú)需依賴(lài)熒光設(shè)備的閉管可視化檢測(cè)方法，為POCT中核酸可視化檢測(cè)提供一種新策略。

目前已經(jīng)有一種集核酸擴(kuò)增、級(jí)聯(lián)核酸侵入反應(yīng)及納米金探針雜交反應(yīng)的閉管核酸檢測(cè)技術(shù)(見(jiàn)專(zhuān)利“耦合核酸擴(kuò)增反應(yīng)、核酸侵入反應(yīng)及納米顆粒顯色反應(yīng)的封閉式可視化核酸檢測(cè)新方法”，專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枴?01310478388.1”)，但該方法需要DNA作為初始模板，當(dāng)檢測(cè)RNA病毒時(shí)，需要在管外將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板加入封閉體系進(jìn)行反應(yīng)，操作繁瑣和耗時(shí)。因此，我們開(kāi)發(fā)了一種在單個(gè)閉管體系中可以依次進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、核酸擴(kuò)增偶聯(lián)侵入反應(yīng)及納米金探針雜交顯色反應(yīng)的方法，實(shí)現(xiàn)RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供HiScript II反轉(zhuǎn)錄酶在進(jìn)行RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于RNA病毒核酸的閉管可視化檢測(cè)方法，其步驟包括：

(1)在反應(yīng)管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、核酸擴(kuò)增反應(yīng)偶聯(lián)核酸侵入反應(yīng)、納米金探針雜交顯色反應(yīng)的所有組分，并加入靶核酸RNA；

(2)將反應(yīng)溫度調(diào)至低于納米金探針雜交顯色反應(yīng)的反應(yīng)溫度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；

(3)將反應(yīng)溫度調(diào)高進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，同時(shí)將核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的退火溫度設(shè)置為核酸侵入反應(yīng)的反應(yīng)溫度，使核酸擴(kuò)增反應(yīng)和核酸侵入反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行；

或者將反應(yīng)溫度調(diào)高進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，然后降溫進(jìn)行核酸侵入反應(yīng)；

(4)降低反應(yīng)溫度至納米金探針雜交顯色溫度，進(jìn)行納米金探針的雜交顯色反應(yīng)，通過(guò)肉眼觀察顏色變化判斷結(jié)果；

所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用的反轉(zhuǎn)錄酶是HiScript II反轉(zhuǎn)錄酶。