[發明專利]一種多重定量PCR檢測真菌的方法以及試劑盒

在審

• 申請號: 202211639799.X
• 申請日: 2022-12-20
• 公開（公告）號: CN116121439A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 邵陽;劉佳;趙忞超;那成龍;劉思思;崔月利;郭垚;蔣文;吳衛衛
• 申請（專利權）人: 成都迪飛醫學檢驗實驗室有限公司;迪感醫學科技（成都）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11;C12Q1/6851;C12R1/68;C12R1/645
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產權代理有限公司 32424
• 代理人: 鄧唯

本發明公開了一種利用多重定量PCR技術同時鑒定真菌的方法。本發明針對煙曲霉、新型隱球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四種重要真菌，設計特異性引物和探針，利用多重熒光定量PCR，一次性同時鑒定臨床樣本中是否存在煙曲霉、新型隱球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉感染，減少重要真菌的檢測周期、降低檢測成本，有效實現真菌感染的快速診斷。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測技術及分子診斷領域，具體涉及一種利用多重定量PCR技術同時鑒定四種重要真菌的方法。

背景技術

大多數真菌在環境中無處不在，人們通過吸入孢子或小型酵母細胞會暴露在真菌中。在過去的幾十年中，由于免疫功能低下的患者數量不斷增加，真菌疾病的臨床相關性顯著增加。據不完全估計，我國約7100萬人患有真菌病，除HIV/AIDS或血液系統惡性腫瘤外，多種新的宿主風險因素，尤其是COPD、哮喘和肺癌，均與真菌病有關。根據既往的研究表明，機會性真菌感染的死亡率超過50％，而在感染曲霉菌的骨髓移植受者中，死亡率高達95％。常見的真菌病包括曲霉菌病、毛霉菌病和肺隱球菌病等。

煙曲霉是人類曲霉病的主要原因。在全球范圍內，每年約有480萬例過敏性支氣管肺曲霉病、300萬例慢性肺曲霉病和25萬例侵襲性曲霉病患者。除此之外，煙曲霉已經成為嚴重免疫功能低下患者感染性死亡的最常見原因之一。近年來，毛霉病的發病率在全球范圍內呈上升趨勢，尤其是在印度和中國未控制的糖尿病患者中的發病率非常高。毛霉菌病進展迅速，難以診斷，主要影響免疫功能低下的患者和糖尿病患者。許多病例由于難以從深層組織收集樣本和診斷測試的敏感性低而仍未得到診斷。而微小根毛霉感染引起的正是毛霉病，通常在免疫系統較弱的患者的肺部發現，并且通常會導致致命的后果。新型隱球菌是一種普遍存在的機會性酵母菌。由新型隱球菌引起的隱球菌病在世界范圍內廣泛分布，絕大多數有癥狀的播散性感染患者具有已確定的潛在免疫功能低下狀況。大多數新型隱球菌感染發生在肺部，但是真菌性腦膜炎，特別是作為艾滋病患者的繼發感染，通常是由新型隱球菌引起的。除此之外，隨著近年來mNGS的廣泛應用，診斷為由耶氏肺孢子菌感染引起的耶氏肺孢子菌肺炎也越來越多。它是一種條件性肺部感染性疾病。鑒于耶氏肺孢子菌肺炎的病情進展快、致死率高，耶氏肺孢子菌的快速鑒定有利于及時的抗感染治療、改善預后。

目前臨床上對于真菌檢測技術包括形態學檢查、培養、鑒定、藥敏試驗、免疫學檢測等。但這些方法或是培養時間長，或是特異性低。耶氏肺孢子菌卻是不典型的真菌，沒法通過在培養基上培養進行檢測。而分子生物學技術則具有檢測特異性高、操作簡單且方便、價格低廉等特點，在真菌檢測方面具有一定的應用。但由于傳統的qPCR只能檢測單個物種，若檢測多個物種時，則需要重復操作，不僅實驗過程耗時長、而且檢測成本高，無法滿足臨床快速診斷病原的需求。因此，開發一種能夠快速鑒定多種常見真菌的方法顯得十分重要。

發明內容

本發明提供一種利用多重定量PCR技術同時鑒定四種常見真菌的方法，能夠一次性同時檢測煙曲霉、新型隱球菌、耶氏肺孢子菌和微小根毛霉四種重要真菌，具有靈敏度高、特異性強、檢測周期短、效率高、成本低等優勢，體現出更高的可行性與應用前景。

一種多重定量PCR檢測真菌的試劑盒，其中包括有用于多重定量PCR反應對真菌進行檢測的引物組合，所述的引物組合包括：

用于對煙曲霉進行進行檢測的正反向引物對，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1-2所示；

用于對新型隱球菌進行進行檢測的正反向引物對，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4-5所示；

用于對耶氏肺孢子菌進行煙曲霉進行檢測的正反向引物對，核苷酸序列如SEQ?IDNO.7-8所示；

用于對進行微小根毛霉進行檢測的正反向引物對，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.10-11所示。

所述的試劑盒中還包括分別對擴增產物進行報告的探針組合；所述的探針組合包括：