[發(fā)明專利]雪蓮細胞的快速懸浮培養(yǎng)和遺傳轉化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211631251.0
• 申請日: 2022-12-19
• 公開（公告）號: CN115786232B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設計）人: 付春祥;吳振映;徐悅;孔秀雅;劉雨辰;許潤海
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 長沙準星專利代理事務所(普通合伙) 43241
• 代理人: 白甲坡

1.一種雪蓮細胞的快速懸浮培養(yǎng)和遺傳轉化的方法，其特征在于，所述方法步驟如下：

(1)選取顆粒飽滿的雪蓮種子，加300mg·L^-1赤霉素浸泡雪蓮種子過夜；

(2)第二天將種子置于8-12％的次氯酸鈉浸泡10-20min，無菌水沖洗，然后泡在0.5-1.5％的過氧化氫溶液48h；

(3)取出種子晾干，將種子置于MS0培養(yǎng)基，在24℃下，光周期為16h光照，8h黑暗，培養(yǎng)30-40d；所述的MS0培養(yǎng)基是在MS含量減半的基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為15g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝膠，pH值為6；

(4)等到雪蓮種子發(fā)芽后，選取已經(jīng)確定的無菌苗置于MS0培養(yǎng)基，在24℃下，光周期為8h光照，16h黑暗，培養(yǎng)30-40d；

(5)將得到的雪蓮的無菌苗，待無菌苗長到6-8cm，將苗子剪碎約0.5-1cm的正方形；置于愈傷誘導培養(yǎng)基3/4MS，在24℃下，暗培養(yǎng)；所述3/4MS培養(yǎng)基是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1植物凝膠，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–16-BA，pH值為6；

(6)雪蓮25-30d長出愈傷，將新長出的愈傷從雪蓮葉片上剝離下來，用手術刀將愈傷切碎；將切好的愈傷置于加入100mL3/4MS愈傷誘導水培培養(yǎng)基中250mL的搖瓶中，在24℃下，黑暗培養(yǎng)40-50d；所述3/4MS水培培養(yǎng)基是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，pH值為6；

(7)后續(xù)雪蓮水培愈傷進入快速期，每隔15天繼代一次；

(8)提前制備侵染液：凍融法將質粒轉到EHA105農(nóng)桿菌中，篩選出陽性菌落，置于-80℃冰箱備用；取出菌液與相應抗生素LB中搖菌，當OD₆₀₀＝0.4-0.5時加入乙酰丁香酮終濃度為100μmol·L^–1，2h后離心富集菌液，使用3/4MS侵染液重懸為OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制備完成；所述3/4MS侵染液是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值為6；

(9)將懸浮愈傷系浸泡到制備好的侵染液中里，同時真空抽濾10min，超聲5min，抽真空10min，后將水培愈傷用濾紙晾干，于超凈臺中吹約1-2h，置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基3/4MS AS共培養(yǎng)兩天；所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基3/4MS AS是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–1 6-BA，4g·L^-1植物凝膠，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值為6；

(10)將懸浮愈傷轉移到篩選培養(yǎng)基3/4MS培養(yǎng)基誘導愈傷1個月；所述篩選培養(yǎng)基3/4MS是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，1.5mg·L^–1NAA，1mg·L^–16-BA，4g·L^-1植物凝膠，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1，pH值為6；

(11)將新長出的愈傷轉移到分化篩選培養(yǎng)基3/4MS誘導再生芽3-4個月；所述分化篩選培養(yǎng)基3/4MS是在MS含量0.75倍基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為30g·L^-1蔗糖，0.1mg·L^–1NAA，3mg·L^–16-BA，4g·L^-1植物凝膠，300mg·L^–1特美汀，1mg·L^–1草銨膦，pH值為6；

(12)將誘導出來的芽轉移到MS0生根培養(yǎng)基生根2-3周；所述的MS0生根培養(yǎng)基是在MS含量減半的基礎培養(yǎng)基中，含有終濃度為15g·L^-1蔗糖，0.3mg·L^–1NAA，4g·L^-1植物凝膠，pH值為6。

2.利用權利要求1所述方法對雪蓮進行轉基因的應用。