[發(fā)明專利]一種PPFIBP1-RET融合基因及其檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211627423.7
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116334114A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 田玉琦;蔡鑫勇;楊歡歡;陳艷莉
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 杭州信與義專利代理有限公司 33450
• 代理人: 萬景旺

本發(fā)明公開了一種PPFIBP1和RET融合基因，屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域。其中，所述融合基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明還公開了檢測融合基因表達的試劑盒和方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新型的融合基因，為癌癥尤其是肺癌的篩查或診斷提供了更多的指標(biāo)。本發(fā)明基于熒光定量PCR技術(shù)檢測所述融合基因表達，特異性強、靈敏度高、簡便快捷、操作簡單安全、自動化程度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種PPFIBP1-RET融合基因及其檢測試劑盒、檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

RET基因位于10號染色體的長臂上，編碼一個受體酪氨酸激酶。在正常的神經(jīng)元、交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)節(jié)、甲狀腺C細(xì)胞、腎上腺髓細(xì)胞、泌尿生殖道細(xì)胞、睪丸生殖細(xì)胞都有表達。RET蛋白活化后會激活下游的信號通路(包含RAS、MAPK、ERK、PI3K、AKT等)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和分化。

染色體發(fā)生重排導(dǎo)致的RET基因融合也發(fā)生在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，RET基因融合在NSCLC的頻率約為1％-2％，目前四個RET基因的融合伴侶基因被鑒定出來，分別是KIF5B、CCDC6、TRIM33和NCOA4。臨床上還有更多的RET基因融合伴侶基因有待發(fā)掘，以提高NSCLC的檢測準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，發(fā)明人在非小細(xì)胞肺癌臨床樣本研究中意外地發(fā)現(xiàn)了一種新型RET基因融合類型，即與PPFIBP1基因融合，并開發(fā)基于熒光定量PCR技術(shù)檢測PPFIBP1-RET基因融合突變的方法，從而完成本發(fā)明。

本發(fā)明第一方面提供一種PPFIBP1和RET融合基因，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

該融合基因的斷點發(fā)生在PPFIBP1基因7號內(nèi)含子上和RET基因11號內(nèi)含子上。斷點前序列如SEQ?ID?No.2所示，屬于PPFIBP1基因；斷點后序列如SEQ?ID?No.3所示，屬于RET基因。

PPFIBP1基因編碼的PPFIBP1蛋白是LAR蛋白-酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白(liprin)家族的成員。Liplin家族蛋白與跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶LAR家族的成員相互作用，對軸突引導(dǎo)和乳腺發(fā)育很重要。

RET基因是一個原癌基因，全名：proto-oncogene?tyrosine-protein?kinasereceptor?Ret，位于10號常染色體長臂(10q11.2)，全長60kb，包含21個外顯子，編碼1100個氨基酸的酪氨酸激酶受體超家族RET蛋白。RET基因在器官生成和神經(jīng)發(fā)育中起到重要的作用。

上述融合基因發(fā)生在基因組層面，其轉(zhuǎn)錄本(即RNA)的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(即cDNA)的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示。

本發(fā)明第二方面提供一種載體，其包含本發(fā)明第一方面所述的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)序列。該載體可以用于制備陽性對照品。

本發(fā)明第三方面提供用于檢測本發(fā)明第一方面所述融合基因表達的試劑盒，包括用于擴增所述融合基因的轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的第一引物對和靶向所述第一引物對的擴增產(chǎn)物的第一探針，所述第一引物對的上下游引物分別具有SEQ?ID?No.5和SEQ?IDNo.6所示核苷酸序列，所述第一探針具有SEQ?ID?NO.7所示核苷酸序列。

進一步地，所述試劑盒還包括用于擴增內(nèi)參基因REF的第二引物對和靶向所述第二引物對的擴增產(chǎn)物的第二探針，其中，所述第二引物對的上下游引物分別具有SEQIDNO.8和SEQ?ID?NO.9所示核苷酸序列，所述第二探針具有SEQ?ID?NO.10所示核苷酸序列，所述第二探針和所述第一探針利用不同熒光進行標(biāo)記。

在本發(fā)明的一些實施方案中，所述第一探針，熒光基團連接在探針序列的5'端，選擇FAM基團，淬滅基團連接在探針的3'端，選擇BHQ1基團；所述第二探針，熒光基團連接在探針序列的5'端，選擇ROX基團，淬滅基團連接在探針的3'端，選擇BHQ2基團。