[發明專利]一種煙草根結線蟲的室內培養方法

在審

• 申請號: 202211621119.1
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN115885937A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 毛明林;楊潤霞;李誠;葉敏;趙崇鈞;潘菲;尚海麗
• 申請（專利權）人: 云南省微生物發酵工程研究中心有限公司
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 昆明鴻昊知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 53211
• 代理人: 陳芃綦

1.一種煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：禾谷鐮刀菌的分離純化及培養，將赤霉病發病病株的秸稈利用組織分離和單孢純化培養法得到禾谷鐮刀菌純化菌種；

步驟2：禾谷鐮刀菌種子液制備，將步驟1所得的禾谷鐮刀菌利用打孔器打孔后挑取接種至液體PDA培養基中，在溫度為27℃-28℃條件下，轉速為180r/min條件下培養72h，得到禾谷鐮刀菌種子液，即為禾谷鐮刀菌菌懸液；菌懸液的有效活菌數控制在0.50×10⁸cfu/g以上；

步驟3：用于培養煙草根結線蟲的禾谷鐮刀菌平板的制作，將所得禾谷鐮刀菌種子液吸取100-200uL至固體PSA培養基上涂布均勻，后放置于28℃恒溫培養箱中培養5-7天，直至菌絲長滿平板備用；

步驟4：通過過篩法篩選得到煙草根結線蟲蟲卵和煙草根結線蟲，利用移液槍將煙草根結線蟲收集到燒杯中，并用蒸餾水稀釋配制成煙草根結線蟲的含量為200條/10mL的菌懸液；

步驟5：在無菌條件下吸取1mL所述菌懸液接種至長滿禾谷鐮刀菌的固體PSA平板上，左右搖晃使長滿禾谷鐮刀菌的固體PSA培養基完全浸透菌絲并與菌絲混勻，且使煙草根結線蟲懸浮液液滴浸沉于PSA平板中；

步驟6：用封口膜將培養皿進行封口，培養皿正面朝上，培養皿在28℃恒溫培養箱中，且在黑暗條件培養7-14天，用無菌水沖洗PSA平板獲取煙草根結線蟲懸液，收集到煙草根結線蟲懸浮液。

2.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，液體PDA培養基的制備方法包括如下步驟：稱取馬鈴薯200g，葡萄糖20g，配制量為1L，將馬鈴薯洗凈切碎后煮沸30分鐘，利用至少兩層紗布過濾得到濾液，再將稱取好的葡萄糖溶于濾液中，分裝于三角瓶中進行滅菌后得到培養禾谷鐮刀菌的液體PDA培養基。

3.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，固體PSA培養基的制備方法包括如下步驟：取馬鈴薯200g，煮沸30min后過濾，向馬鈴薯中添加蔗糖14g，添加純凈水定容至1L，再添加瓊脂粉18g/L，pH調至7.0-7.4。

4.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，通過過篩法篩選得到煙草根結線蟲懸浮液包括如下步驟：

收集發生煙草根結線蟲的田間土樣及感染煙草根結線蟲的根系組織，將田間土樣及根系組織洗凈后剪碎放入容器中，根系組織剪碎至0.5-1cm；

向容器中添加純凈水淹沒樣品后充分攪勻使煙草根結線蟲懸浮起來，或將容器置于28℃恒溫搖床中搖勻0.5-1h，靜置3-5min使泥土或植株組織下沉，收集含煙草根結線蟲的懸浮液，煙草根結線蟲懸浮液中煙草根結線蟲的含量為100-300頭/10ml；

將懸浮液注入套有200目、400目及500目的過濾網篩中，用清水沖洗套篩，將篩網中的殘渣收集到燒杯或培養皿中，500目篩網中可收集到煙草根結線蟲蟲卵，400目篩網中可收集到煙草根結線蟲，收集的煙草根結線蟲蟲卵和煙草根結線蟲備用。

5.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，用蒸餾水稀釋配制成煙草根結線蟲的含量為200條/10mL的菌懸液包括如下步驟：將收集的煙草根結線蟲吸取5mL至直徑為6cm的潔凈培養皿平板中，置于解剖鏡下觀察煙草根結線蟲的數量，根據觀察的數量進行加水稀釋至結線蟲的含量為200條/10mL的菌懸液。

6.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，在無菌條件下吸取1mL所述菌懸液接種至長滿禾谷鐮刀菌的固體PSA平板上，包括如下步驟：在無菌超凈臺中開紫外燈照射30min，用1mL移液槍吸取1mL所述菌懸液接種至長滿禾谷鐮刀菌的PSA平板上。

7.根據權利要求1所述的煙草根結線蟲的室內培養方法，其特征在于，收集煙草根結線蟲懸浮液包括如下步驟：將禾谷鐮刀菌菌絲消失的PSA平板用無菌水沖洗，收集洗滌液即得煙草根結線蟲懸浮液。