[發明專利]L-3-氨基異丁酸生產菌株、其構建方法及其用途

在審

• 申請號: 202211618428.3
• 申請日: 2022-12-15
• 公開（公告）號: CN115851799A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 付首穎;楊家森;廖琪林
• 申請（專利權）人: 南京紐邦生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/53;C12N15/31;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/54;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京智造力知識產權代理有限公司 32382
• 代理人: 汪麗紅;徐波

本發明提供了一種構建L?3?氨基異丁酸生產菌株的方法、所構建的L?3?氨基異丁酸生產菌株以及其用于發酵生產L?3?氨基異丁酸的用途。使過表達glmE、mutS和gad的質粒以及過表達ppsA、icd、ppc和gltA的質粒在W3110(ΔptsGΔsucA)底盤菌中共表達，構建得到L?3?氨基異丁酸生產菌株。本發明構建的大腸桿菌工程菌能夠以葡萄糖為底物，生產純手性L?3?氨基異丁酸，搖瓶產量可達580mg/L。

技術領域

本發明屬于代謝工程領域，具體涉及一種L-3-氨基異丁酸生產菌株、其構建方法及其用于生產L-3-氨基異丁酸的用途。

背景技術

3-氨基異丁酸，也稱β-氨基異丁酸(BAIBA)，它是一種來自胸腺嘧啶和纈氨酸分解代謝的非基因編碼氨基酸。3-氨基異丁酸以兩種異構體形式存在，在人的尿液和血漿中都能檢測到3-氨基異丁酸的兩種對映體。在血漿中，由于腎重吸收活躍，L對映體是主要類型。相比之下，尿液幾乎只包含D-3-氨基異丁酸，但濃度通常很低，因為D-3-氨基異丁酸被3-氨基異丁酸轉氨酶進一步分解為甲基丙二酸半醛和丙酰輔酶A。3-氨基異丁酸通過增加小鼠肝臟的脂肪酸氧化和降低肝臟的脂肪從頭合成可以減少脂肪的含量，可以促成運動對代謝疾病的保護作用，可以改善骨骼肌細胞的胰島素抵抗及炎癥，同時改善Ⅱ型糖尿病引起的代謝異常。此外，3-氨基異丁酸也是重要的化學原料和藥物中間體，有很廣泛的藥用及化用市場前景。

3-氨基異丁酸的主要生產依賴于化學合成，該過程不僅消耗大量的鹽酸，還要使用昂貴的催化劑，最終產生高毒性物質，造成環境污染。2015年Cortes等人通過利用銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)10145發酵與重氮化反應結合，生產D-3-氨基異丁酸；但重氮化并非環境友好，且在人體中具有生理效應的主要是L-3-氨基異丁酸。因此，非常有必要開發環境友好，并且以高產量發酵生產L-3-氨基異丁酸的方法和相關L-3-氨基異丁酸生產菌株。

發明內容

在一個方面，本發明提供了一種構建L-3-氨基異丁酸生產菌株的方法，該方法包括以下步驟：

(1)敲除大腸桿菌W3110基因組上的葡萄糖轉運蛋白基因ptsG和酮戊二酸脫氫酶基因sucA，得到基因敲除菌株W3110；

(2)構建表達谷氨酸變位酶基因glmE、mutS和谷氨酸脫羧酶基因gad的重組表達質粒；

(3)構建表達磷酸烯醇丙酮酸合酶基因ppsA、異檸檬酸脫氫酶基因icd、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因ppc和檸檬酸合酶基因gltA的重組表達質粒；

(4)將步驟(2)中所得的重組表達質粒和步驟(3)中所得的重組表達質粒轉化到基因敲除菌株W3110中，得到L-3-氨基異丁酸生產菌株。

在一些實施方案中，步驟(2)中基因glmE的序列如SEQ ID NO.1所示。在一些實施方案中，glmE可以來源于匙形梭狀芽孢桿菌(Clostridiumcochlearium)。

在一些實施方案中，步驟(2)中基因mutS的序列如SEQ ID NO.2所示。在一些實施方案中，mutS可以來源于破傷風形梭狀芽孢桿菌(Clostridiumtetanomorphum)。

在一些實施方案中，步驟(2)中基因gad的序列如SEQ ID NO.3所示。在一些實施方案中，gad可以來源于嗜熱古細菌(Thermococcus kodakarensis)。

在一些實施方案中，步驟(3)中基因ppsA的序列如SEQ ID NO.4所示。

在一些實施方案中，步驟(3)中基因icd的序列如SEQ ID NO.5所示。

在一些實施方案中，步驟(3)中基因ppc的序列如SEQ ID NO.6所示。

在一些實施方案中，步驟(3)中基因gltA的序列如SEQ ID NO.7所示。在一些實施方案中，ppsA、icd、ppc和gltA可以均來自大腸桿菌W3110。