[發明專利]一種提高基因敲入效率的電穿孔轉染體系制備方法

在審

• 申請號: 202211614273.6
• 申請日: 2022-12-13
• 公開（公告）號: CN115820737A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 夏凱;周婷;趙建龍
• 申請（專利權）人: 上海前瞻創新研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本申請涉及生物技術領域，更具體涉及一種提高基因敲入效率的電穿孔轉染體系制備方法。本申請可顯著提高基因敲入效率，適用于不同基因的敲入；可最大程度地減少電轉體系組分的取樣誤差，降低實驗誤差，增加實驗結果的穩定性；對CRISPR/Cas系統的制備濃度要求低；適用于任何電轉儀器設備的電轉體系。

技術領域

本申請涉及生物技術領域，特別涉及一種提高基因敲入效率的電穿孔轉染體系制備方法。

背景技術

基因敲入(Gene knock in)是利用基因同源重組，將外源的功能基因(基因組原先不存在、或已失活的基因)，轉入細胞與基因組中的同源序列進行同源重組，插入到基因組中，在細胞內獲得表達的技術。該技術在基因功能與分子機制的研究、構建人類疾病的動物模型、基因治療、農業和林業等領域具有重要的應用前景。以TALEN、CRISPR/Cas系統為代表的人工核酸內切酶技術在制備indel(插入或缺失標記)等基因突變體的應用中已較為成熟，但在基因敲入的應用中仍面臨著編輯效率低的困境。基因編輯系統的遞送策略是影響基因敲入(KI)效率的關鍵因素之一，為了獲得最佳的KI效率，已發展了不同的轉染方案，其中，電穿孔轉染方法是一種高效的物理方法，可以實現對基因編輯系統高效的細胞內或細胞核內遞送，使用細胞范圍廣，特別是針對難轉染的干細胞、神經細胞等。

電穿孔轉染細胞的方法是利用瞬間高壓造成細胞膜不穩定，形成電穿孔使得外源DNA、RNA或蛋白等進入細胞。電穿孔轉染法是一種物理方法，無生物與化學毒性副作用，安全性高，操作方便，但其轉染效率也受多種因素影響，除常規的電壓、脈沖時間、電穿次數等因素外，很大程度上還取決于待轉染組分的溶液成分。通常情況下，電轉儀配有專用的電轉液，待轉染的組分、細胞和電轉液需嚴格按照特定的比例添加以制備具有最佳轉染效率的轉染體系，因此對質粒DNA、mRNA或蛋白等待轉染物質的制備濃度要求較高，只有待轉染物質的濃度極高時，才能在滿足轉染體系制備比例的情況下，具有足夠的量獲得較高的編輯效果。同時，在用移液器吸取高濃度待轉物質時，由于微量的體積和移液吸頭的吸附作用，會導致組分實際用量誤差，從而導致轉染效率不穩定，影響實驗結果。這種轉染體系的制備方法要求高、操作也較為繁瑣，不利于使用。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，為解決現有技術中電轉染效率低，基因敲入不穩定的技術問題，本申請的目的在于提供一種提高基因敲入效率的電穿孔轉染體系制備方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本申請第一方面提供一種電轉染方法，包括以下步驟：

1)提供靶向目標基因的CRISPR/Cas9系統；

2)提供靶向目標基因的同源修復模板；

3)將步驟1)所得的CRISRP/Cas9系統和步驟2)所得的同源修復模板干燥成粉末，得到預處理樣品；

4)將步驟3)中的預處理樣品用電轉緩沖溶液重懸，與待轉入的細胞共孵育，形成電轉染體系；

5)將步驟4)所得的電轉染體系進行電擊處理。

本申請第二方面提供前述的電轉染方法用于體外基因敲入的用途。

與現有技術相比，本申請的有益效果為：

1、本申請可顯著提高基因敲入的效率，適用于不同基因的敲入。

2、本申請可最大程度地減少電轉體系組分的取樣誤差，降低實驗誤差，增加實驗結果的穩定性。

3、本申請對CRISPR/Cas系統的制備濃度要求低，不限CRISPR/Cas系統的任何形式。

4、本申請適用于任何電轉儀器設備的電轉體系，不限電轉設備品牌和型號。

附圖說明

圖1顯示為pX330質粒圖譜。