[發明專利]一種絲素親和性工程化外泌體及其構建方法和功能應用

在審

• 申請號: 202211614129.2
• 申請日: 2022-12-15
• 公開（公告）號: CN115960836A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 李倩坤;胡文治;張翠萍;付小兵;楊潤功;續琴
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院第一醫學中心
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C07K19/00;C12N15/62;A61K35/28;A61K47/42;A61P17/00;A61P9/00;A61P19/08;A61P19/04
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

本發明提供了一種絲素親和性工程化外泌體及其構建方法和功能應用，屬于生物醫用材料與細胞分子治療技術領域。本發明通過多輪篩選得到一段與絲素蛋白具有較強親和性的絲素親和肽，將絲素親和肽在外泌體膜蛋白中融合表達有利于增強外泌體與親和蛋白的結合性能，同時外泌體的膜蛋白通過融合表達MS2結構域，可高效捕捉大量特異性miRNA，從而發揮特定的功能作用。絲素蛋白結合絲素親和性工程化外泌體后，提高了外泌體的穩定性及其在受體細胞中的內化效應，為生物分子活性材料在組織修復與再生醫學領域的應用提供了研究基礎，同時為臨床中組織損傷修復的高效精準治療提供了理論和技術支撐。

技術領域

本發明屬于生物醫用材料與細胞分子治療技術領域，具體涉及一種絲素親和性工程化外泌體及其構建方法和功能應用。

背景技術

隨著細胞分子治療技術的快速發展，外泌體治療成為生物醫療領域研究的熱點，并受到廣泛的關注。外泌體是細胞外分泌囊泡中的一員，它可以作為運輸載體，裝載細胞內特定的蛋白和RNA等成分，通過融合到靶細胞膜或者靶細胞胞吞作用攝入，將活性因子直接遞送到靶細胞內部，對受體細胞組織發揮有效調控作用。相比于干細胞治療，干細胞來源的外泌體，不僅含有干細胞分泌的多種有效成分，而且可以避免異種來源細胞表面抗原帶來的一過性排異反應，在臨床治療應用上更加安全。目前，以工程化修飾的外泌體為載體裝載特定基因和活性藥物等有效成分從而獲得具備特異調控作用的功能性外泌體，成為外泌體治療的應用熱點與發展方向。然而，功能性外泌體需要有效的緩釋保存模式來發揮持續性調控作用。

在臨床治療過程中，給藥方式與治療效果直接相關，如果藥物無法有效地持續作用機體，那么治療效果往往大打折扣。外泌體的半衰期很短，活性保持困難，而生物材料作為活性分子載體，可為外泌體治療模式開啟無限可能。功能性外泌體與生物材料相結合用于靶向調控分子的持續輸送，有望為各類創傷修復的精準治療帶來新的希望。外泌體結合生物活性材料已經開始應用于皮膚、心血管以及骨與軟骨等組織的損傷修復治療。在組織修復與再生生物材料中，絲素蛋白作為天然的蛋白成分具有抗菌性，可防止病原體的侵襲和增殖，從而降低感染的風險，加之良好的生物相容性、可降解性及優良的機械性能，使其成為組織修復與再生應用中新的生物材料研究方向。值得注意的是，絲素蛋白材料對外泌體的加載能力可能與外泌體在生物材料上的結合效率密切相關。如何增強外泌體與絲素蛋白的高效結合與持續釋放是構建絲素親和性工程化外泌體的關鍵技術問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種絲素親和性工程化外泌體及其構建方法，使構建的絲素親和性工程化外泌體在絲素蛋白中具有高效結合和持續釋放特性。

本發明的目的還在于提供一種結合絲素蛋白的功能性外泌體，具有持續內化作用，具有良好的保存穩定性和體內穩定性，從而能有效提高外泌體活性成分的療效。

本發明提供了一種絲素親和性工程化外泌體，所述外泌體的膜蛋白為融合表達有絲素蛋白結合肽的膜蛋白Lactadherin；

所述絲素蛋白結合肽插入膜蛋白Lactadherin中SP和C1C2結構域之間；

所述絲素蛋白結合肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

優選的，所述融合表達有絲素蛋白結合肽的膜蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

優選的，所述外泌體裝載miR146a；所述外泌體的膜蛋白還為融合表達MS2結構域；

所述MS2結構域在膜蛋白Lactadherin中C1C2結構域的C端表達；

所述MS2結構域的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

本發明提供了一種所述絲素親和性工程化外泌體的構建方法，包括以下步驟：

1)構建含融合表達有絲素蛋白結合肽的膜蛋白的編碼序列的慢病毒質粒；