[發明專利]一種Mesothelin抗原免疫組化參考品構建以及對應抗體篩選

在審

• 申請號: 202211610206.7
• 申請日: 2022-12-14
• 公開（公告）號: CN115792209A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 王恩秀;李強
• 申請（專利權）人: 南京卡提醫學科技有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;C12N15/867;G01N33/68
• 代理公司: 南京源點知識產權代理有限公司 32545
• 代理人: 王佳妹

本發明公開了一種Mesothelin免疫組織化學參考品構建的方法和應用，先將Mesothelin序列構建成質粒，再通過大腸桿菌擴培，提取出的質粒然后包裝成慢病毒，通過慢病毒感染SKOV3細胞，將Mesot helin抗原表達在SKOV3細胞表面，獲得高表達Mesothelin抗原的SKO V3細胞命名為SKOV3?a，再使用該SKOV3?a在免疫缺陷小鼠皮下造模，成瘤后取瘤進行包埋切片，再用該切片去優化購買的商業化Mes othelin。這樣充足來源的切片，可以篩選出高效穩定的抗體，經濟節約并且效果好。

技術領域

本發明涉及免疫學領域，具體涉及一種Mesothelin抗原免疫組化參考品構建以及對應抗體篩選。

背景技術

間皮素(mesothelin，MSLN)最初發現是一個能被單克隆抗體K1特異性識別的抗原，從與K1發生反應的HELA細胞系基因文庫中提取CDNA并克隆出了MSLN基因，由于該基因編碼生成的膜結合蛋白主要位于正常間皮細胞表面，故命名為間皮素。近年來發現MSL N作為一種腫瘤分化抗原，在惡性間皮瘤、肺癌、食管癌、胰腺癌、宮頸癌以及卵巢癌等惡性腫瘤中呈過度表達。惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病，“手術、放療與化療”三大常規療法對人體傷害極大，而且腫瘤極易復發，但是利用該特異性靶點可以做成靶向藥以及現在比較流行的CAR-T，可以有效的抑制或消滅實體腫瘤。但是需要篩選出該靶點的有效抗體，市面上MSLN抗體非常多，篩選難度極大，另外免疫組化的方法為最直接最直觀的篩選方式之一。免疫組織化學所使用的該抗原的陽性表達的組織切片，費用非常高且來源單一，且切片質量不搞，很多都是低表達或者陰性表達Mesothelin抗原組織切片，所以使用該方法，可以有快速的制作出大量的廉價且質量高的切片，來驗證MSLN抗體。

間皮素靶點目前利用非常廣，想篩選出有效抗體，現有的使用免疫組織化學的篩選方案需要大量的高表達Mesothelin抗原組織切片。現有的切片來源主要是腫瘤病人的瘤塊穿刺再切片，或者利用低表達的細胞制作成的切片。并沒有利用基因技術自己構建高表達細胞再制作成高表達且均一的切片。

發明內容

為了克服現有技術的問題，本發明構建高表達的Mesothelin抗原細胞，另外在免疫缺陷小鼠的皮下造模。

一種Mesothelin抗原免疫組化參考品構建以及對應抗體篩選方法，在普通或低表Mesothelin抗原細胞的基礎上，通過Mesothelin序列構建質粒，包裝成慢病毒，慢病毒轉染的方式使其高表達Mesothe lin抗原，再通過皮下造模，取瘤塊制作成切片，使用該切片優化Me sothelin抗體。

進一步地，所述普通或低表Mesothelin抗原細胞，容易在免疫缺陷小鼠完成皮下造模。

進一步地，所述的Mesothelin序列，經過反復實驗驗證篩選出的序列。

進一步地，所述的質粒，Mesothelin抗體經過反復實驗驗證質粒結構。

進一步地，所述切片為石蠟包埋的連續切片，厚度在0.4um，使用防脫片載玻片，用于免疫組化實驗。

進一步地，所述Mesothelin抗體為普通的商業化或自己合成或重新篩選出的抗體。

高表達的Mesothelin抗原細胞方法如下：

1、將Mesothelin序列構建成質粒，經過測序和qPCR驗證質粒構建效率和質量。

2、構建好的質粒使用大腸桿菌進行擴增培養，培養后使用質粒大提試劑盒進行質粒提取。

3、使用提取的質粒進行慢病毒包裝。

4、使用慢病毒再去感染腫瘤細胞，腫瘤細胞選用低表達Mesoth elin抗原細胞SKOV3。

5、將感染的細胞使用滅瘟素進行藥篩，將沒有轉染成功的細胞殺死。