[發明專利]一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法

在審

• 申請號: 202211604831.0
• 申請日: 2022-12-14
• 公開（公告）號: CN116297352A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 劉朋歡;崔志英;毛磊;鄭馳;趙宇;江曉欣
• 申請（專利權）人: 寧波永新光學股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/01
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 程曉明

1.一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法，其特征在于包括以下步驟：

S1：使用共聚焦熒光顯微鏡對熒光微球測試片進行拍攝；

S2：對拍攝的熒光微球圖像進行篩選；

S3：對篩選出來的微球進行平均以抑制噪聲，然后使用高斯核函數，進行最小二乘法擬合，得到系統的點擴散函數；

S4：通過測量得到系統點擴散函數的橫向和軸向的半峰全寬的實驗值，將其與理論值進行比較來評價共聚焦熒光顯微鏡系統的質量；

S5：根據得到的系統點擴散函數(PSF)形狀，通過以下方法對共聚焦熒光顯微鏡進行校準：

2.根據權利要求1所述的一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法，其特征在于步驟S1對熒光微球測試片進行拍攝的具體方法如下：

S1.1選擇熒光微球測試片：選用不同顏色的混合微球測試片，熒光微球的尺寸選擇小于共聚焦熒光顯微鏡系統理論分辨率的二分之一，對于NA＝0.6的浸沒物鏡，熒光微球的尺寸小于175nm；封固劑固化后折射率與顯微鏡透鏡折射率一致；激光器的波長選用與熒光微球染料匹配的波長；

S1.2調整儀器：將激光器預熱至少1小時，清潔物鏡，移除所有的微分干涉顯微鏡學元件，調整矯正環，使用均勻的與所選微球染料匹配的熒光塑料片校準針孔位置以確保視場中的最大亮度是居中的，校準時激光器功率為8μW，探測器增益為500V，縮放系數設置為1-2，掃描速度為每像素7-9微秒，設置顏色查找表LUT，以使信號的視覺差異盡可能明顯，確保聚光鏡和物鏡都聚焦在同一個焦平面，對準激光并使用透射光探測器進行成像測試，確保顯微鏡聚焦穩定，且系統周圍溫度穩定；

S1.3拍攝熒光微球圖像：將共聚焦熒光顯微鏡圖像采集設置為以每個像素停留5-25μs的掃描速度單向掃描1024×1024像素的圖像幀，縮放系數設置為2-3，設置每像素比特數為8或12或16；設置探測器PMT增益為600-750V，再調整PMT增益和激光功率，使微球的平均光強為圖像中最大光強的75％；使用連續掃描模式，以確保圖像內沒有飽和的像素；數字增益設置為1；針孔設置為1艾里單位；根據系統的放大倍率，在軟件中設定像素數目，以確保圖像像素尺寸至少小于物鏡分辨率的三分之一，其中共聚焦熒光顯微鏡的橫向像素大小和軸向像素大小由下列公式給出：

式中λ_exc為激發波長，n為浸沒介質的折射率，NA為物鏡的NA值。

3.根據權利要求1所述的一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法，其特征在于步驟S2對拍攝的熒光微球圖像進行篩選，具體方法如下：

調整焦面，計算每個熒光微球和周圍背景信號的信噪比，選出信噪比排名靠前的20～30個熒光微球，并確保選中的熒光微球靠近中心視場，且相互距離不小于15微米，篩選出圖像中最暗的一組熒光微球用于分析。

4.根據權利要求3所述的一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法，其特征在于篩選熒光微球時從20～30個熒光微球選擇圖像中最暗的10-20個微球進行標記和預篩，然后對預篩選出的熒光微球進行二值化處理，確認這些熒光微球形狀規則合理且沒有聚集，并從中再次挑選出最優的5-10個熒光微球，對篩選出的多個熒光微球，按照微球直徑的20倍畫出大小統一的視場，并確保微球在畫出視場的正中心，對多個畫出視場的信號求平均值。

5.根據權利要求1所述的一種共聚焦熒光顯微鏡的質量評價和校準方法，其特征在于步驟S4中通過測量得到系統點擴散函數的橫向和軸向的半峰全寬的實驗值是指點擴散函數的x,y,z軸的半峰全寬值。