[發(fā)明專利]釀酒酵母從頭合成柚皮素工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211596170.1
• 申請日: 2022-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN115851810A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳志強(qiáng);金黎媛;趙嫚;成浩;鄭裕國
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N1/19;C12N15/60;C12N15/52;C12N15/54;C12N15/61;C12N9/88;C12N9/00;C12N9/10;C12N9/90;C12P17/06;C12R1/865
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;黃競云

本發(fā)明公開了一種釀酒酵母從頭合成柚皮素工程菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，上述工程菌按如下方法對釀酒酵母S.cerevisiae CEN.PK2?1C基因組進(jìn)行改造構(gòu)建：敲除底物競爭途徑基因和過表達(dá)抗反饋抑制基因等提高前體物質(zhì)酪氨酸的代謝通量j異源表達(dá)酪氨酸解氨酶、4?香豆酰：CoA?連接酶、查爾酮合酶和查爾酮異構(gòu)酶實(shí)現(xiàn)柚皮素的從頭合成。最后，通過多拷貝位點(diǎn)高效表達(dá)Sc4CL和HaCHS進(jìn)一步提升了柚皮素的產(chǎn)量。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種采用增強(qiáng)酪氨酸代謝通量和基因組delta多拷貝位點(diǎn)整合促進(jìn)異源基因高效表達(dá)的組合策略，尤其涉及一種生產(chǎn)柚皮素的釀酒酵母工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

柚皮素是黃酮類化合物的核心骨架結(jié)構(gòu)，作為平臺(tái)化合物可衍生大量黃酮類物質(zhì)，具有抗病毒、抗菌、抗高血壓和抗氧化等多種生理活性，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。鑒于植物提取和化學(xué)合成的局限性，柚皮素的生物合成已成為研究熱點(diǎn)。以植物代謝途徑為參照，目前已報(bào)道的異源合成柚皮素有2條代謝通路：以酪氨酸為底物，在酪氨酸解氨酶(TAL)催化下生成對香豆酸，隨后在4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)催化下合成對香豆酰-CoA，再經(jīng)由查爾酮合酶(CHS)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)催化下分別合成柚皮素查爾酮和柚皮素；由酪氨酸合成柚皮素的途徑是目前研究的熱門方案。在另一條途徑中，由苯丙氨酸通過5步酶催化反應(yīng)合成柚皮素，分別為：苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4CL、CHS和CHI。苯丙氨酸合成方案涉及了C4H，該酶屬于P450酶，需要由P450還原酶將其轉(zhuǎn)化為氧化還原形態(tài)，并且需要錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上完成催化反應(yīng)，限制了該通路在原核表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

通過微生物發(fā)酵法來合成柚皮素是降低黃酮類化合物成本的理想來源，同時(shí)也滿足綠色、資源環(huán)保理念。釀酒酵母作為GRAS(generally regarded as safe)生物，具有良好的遺傳背景、優(yōu)異的抗逆性、優(yōu)異的發(fā)酵特性、穩(wěn)定的生產(chǎn)性能和較高的安全性，已成為生產(chǎn)柚皮素的一種有吸引力的微生物宿主。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)酪氨酸的釀酒酵母工程菌，所述的工程菌以S.cerevisiae CEN.PK2-1C為底盤菌，通過代謝改造，得到高產(chǎn)L-酪氨酸的釀酒酵母T01菌株。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種實(shí)現(xiàn)并強(qiáng)化柚皮素從頭合成的釀酒酵母工程菌。所述工程菌是以高產(chǎn)酪氨酸T01菌株為宿主，以高拷貝2μ質(zhì)粒過表達(dá)RgTAL和Sc4CL，實(shí)現(xiàn)柚皮素從頭合成菌株(N01)的構(gòu)建；隨后，通過將Sc4CL和HaCHS表達(dá)盒整合至delta位點(diǎn)(該菌株命名為N02)，顯著促進(jìn)了柚皮素的合成并對生物量無明顯影響。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒含有酪氨酸解氨酶基因(TAL)和4-香豆酸:輔酶A連接酶基因(4CL)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的載體為pESC-His，所述酪氨酸解氨酶基因連接有TEF啟動(dòng)子控制表達(dá)。另外，為進(jìn)行質(zhì)粒篩選，所述TEF啟動(dòng)子還可攜帶篩選基因，如潮霉素抗性基因。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述酪氨酸解氨酶基因編碼如SEQ ID NO:6所示氨基酸序列，來源于Rhodotorula glutinis；所述4-香豆酸:輔酶A連接酶基因編碼如SEQ IDNO:7所示氨基酸序列，來源于Streptomyces coelicolor。上述基因在插入宿主菌時(shí)需要相應(yīng)做密碼子優(yōu)化為本領(lǐng)域的公知常識(shí)。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)質(zhì)粒被命名為pESC-TAL-4CL-HygR質(zhì)粒。