[發(fā)明專利]一種用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)基、試劑盒和培養(yǎng)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211592124.4
• 申請(qǐng)日: 2022-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115820563A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王躍嗣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濱州醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N5/0793;C12N15/861;C12N15/867;C12N15/113
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 薛紅凡

1.一種用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)基，其特征在于，包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下含量組分：丙戊酸0.01～20mM，TGFβR-1/ALK5抑制劑1～50μM，CDK1/cyclinB和GSK-3β抑制劑1～50μM，毛喉素3～50μM，ROCK-I和ROCK-II抑制劑總摩爾濃度3～50μM，重組人音猬因子10～300ng/ml，成纖維生長(zhǎng)因子8B10～300ng/ml和堿性成纖維生長(zhǎng)因子5～100ng/ml。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括以下含量組分：丙戊酸0.1～1mM，TGFβR-1/ALK5抑制劑2～8μM，CDK1/cyclinB和GSK-3β抑制劑3～9μM，毛喉素5～8μM，ROCK-I和ROCK-II抑制劑總摩爾濃度5～10μM，重組人音猬因子90～110ng/ml，成纖維生長(zhǎng)因子8b90～110ng/ml和堿性成纖維生長(zhǎng)因子15～25ng/ml。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)基，其特征在于，還包括成熟培養(yǎng)基；

所述成熟培養(yǎng)基為毛喉素1～50μMμM，CDK1/cyclinB和GSK-3β抑制劑1～50μM，維生素C0.1～30mM，重組人音猬因子10～300ng/ml，成纖維生長(zhǎng)因子8b10～300ng/ml，堿性成纖維生長(zhǎng)因子5～300ng/ml和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子5～100ng/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)基，其特征在于，所述成熟培養(yǎng)基為毛喉素5μM，CDK1/cyclinB和GSK-3β抑制劑1μM，維生素C2mM，重組人音猬因子100ng/ml，成纖維生長(zhǎng)因子8b100ng/ml，堿性成纖維生長(zhǎng)因子20ng/ml和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子10ng/ml。

5.一種用于體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述培養(yǎng)基和以下一種組分：miR-34b、miR-34b衍生物和miR-34b模擬物。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述miR-34b的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；

所述miR-34b衍生物包括攜帶有所述miR-34b的重組慢病毒載體或攜帶有所述miR-34b的重組腺病毒載體；

所述miR-34b模擬物為miR-34b的mimics。

7.miR-34b或其衍生物/模擬物和權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)所述培養(yǎng)基或權(quán)利要求5或6所述試劑盒在體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元中的應(yīng)用。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述體細(xì)胞包括以下至少一種：成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞、尿液來(lái)源的細(xì)胞和毛囊細(xì)胞。

9.一種由體細(xì)胞重編程為多巴胺神經(jīng)元的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

將miR-34b導(dǎo)入體細(xì)胞中，得到導(dǎo)入有miR-34b的體細(xì)胞；

將導(dǎo)入有miR-34b的體細(xì)胞依次在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中重編程誘導(dǎo)和在成熟培養(yǎng)基中成熟誘導(dǎo)，得到多巴胺神經(jīng)元；

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為權(quán)利要求1或2所述培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

所述成熟培養(yǎng)基為權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基中成熟培養(yǎng)基。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述培養(yǎng)方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)染時(shí)，miR-34b衍生物或miR-34b模擬物的摩爾數(shù)、轉(zhuǎn)染試劑的體積和細(xì)胞數(shù)量的比值為6～30pmol：1～3μl：2×10⁴～5×10⁴；

所述重編程誘導(dǎo)的方法為在轉(zhuǎn)染第1～2天時(shí)，補(bǔ)加誘導(dǎo)培養(yǎng)基300μl/孔，第3天時(shí)進(jìn)行抗生素篩選，第4天時(shí)更換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2～4天；

所述成熟誘導(dǎo)的方法為將重編程誘導(dǎo)后的細(xì)胞在成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～6天，每2天更換一次成熟培養(yǎng)基。