[發明專利]具有頭孢菌素C酰基轉移酶活性的多肽及其用途

在審

• 申請號: 202211567142.7
• 申請日: 2022-12-07
• 公開（公告）號: CN115851687A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 樸哲;王垠善;李紅仙;李美京;孫兒懔;林秀稹
• 申請（專利權）人: 艾美科健株式會社
• 主分類號: C12N9/80
• 分類號: C12N9/80;C12N15/55;C12N1/21;C12N15/70;C12P35/02;C12R1/19
• 代理公司: 北京銀龍知識產權代理有限公司 11243
• 代理人: 鐘海勝;宋琴芝

本文公開了具有頭孢菌素C(CPC)酰基轉移酶活性的多肽及其用途。更具體地，提供了突變型CPC酰基轉移酶以及該突變型CPC酰基轉移酶用于生產7?氨基頭孢烷酸(7?ACA)的用途，該突變型CPC酰基轉移酶包含引入其中的點突變，從而表現出提高的酶活性和/或穩定性。

技術領域

本申請要求于2021年12月24日提交的第10-2021-0187761號韓國專利申請的優先權權益，其全部內容通過引用并入本文。

本說明書涉及具有頭孢菌素C(CPC)酰基轉移酶活性的多肽及其用途，更具體地，涉及其中引入了點突變并因此表現出提高的酶活性和/或穩定性的突變型CPC酰基轉移酶，及其用于生產7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的用途。

背景技術

頭孢菌素C(以下簡稱“CPC”)是β-內酰胺類抗生素家族，由諸如產黃枝頂孢霉(Acremonium chrysogenum)的微生物產生。CPC通過抑制革蘭氏陰性菌細胞壁的合成而表現出對革蘭氏陰性菌的抗菌活性，但由于其活性很弱，發現主要應用于制備半合成頭孢類抗生素(以下簡稱“頭孢菌素”)的原料。其中，通過從CPC脫去D-α-氨基己二酰側鏈而獲得的7-氨基頭孢烷酸(以下簡稱“7-ACA”)被用作大多數頭孢菌素的原料，占全球抗生素市場的高于40％。

通常，由CPC制備7-ACA有化學方法和酶促方法。由于化學方法需要復雜的反應條件和高昂的環境處理成本，近來7-ACA的生產趨向于采用環境友好的酶促方法。

典型的酶促方法由以下兩個步驟組成：第一步，CPC通過D-氨基酸氧化酶(以下簡稱“DAO”)的酶促反應轉化為戊二酰-7-氨基頭孢烷酸(以下簡稱“Gl-7-ACA”)；第二步，通過Gl-7-ACA酰基轉移酶的酶促反應將Gl-7-ACA轉化為7-ACA(見圖1左側的反應方案)。

然而，兩步酶促法存在產率低的缺點，因為第一步的酶促反應中產生的過氧化氫會攻擊底物(CPC)、反應產物(Gl-7-ACA)和DAO。

建議作為解決該問題的替代方法是直接由CPC生產7-ACA的單步酶促方法，而不進行第一步(參見圖1中右側反應方案)。為此，需要催化由CPC直接生產7-ACA的CPC酰基轉移酶。由于CPC酰基轉移酶在自然界中不存在，它是通過修飾天然存在的各種類型的Gl-7-ACA酰基轉移酶(也稱為戊二酰基酰胺酶(GA))而合成的。然而，Gl-7-ACA酰基轉移酶對CPC的活性較差。

因此，需要開發對CPC具有優異的酶活性的CPC酰基轉移酶。

發明內容

本文提供了一種對頭孢菌素C(以下簡稱“CPC”)具有提高的酶活性的CPC酰基轉移酶及其用途。

一方面提供了一種突變型CPC酰基轉移酶，其衍生自包括α-亞基和β-亞基的CPC酰基轉移酶，其中該突變型CPC酰基轉移酶包含通過用不同于相應的原始氨基酸殘基的氨基酸對選自由以下組成的組中的至少一種(一種、兩種、三種、四種或五種)進行取代而發生的突變：

(i)SEQ ID NO：3的α-亞基中的第11位的丙氨酸(A11α)；

(ii)SEQ ID NO：3的α-亞基中的第24位的甘氨酸(G24α)；

(iii)SEQ ID NO：4的β-亞基中的第136位的丙氨酸(A136β)；

(iv)SEQ ID NO：4的β-亞基中的第179位的異亮氨酸(I179β)；和

(v)SEQ ID NO：4(H453β)的β-亞基中的第453位的組氨酸。

在一種實施方式中，突變型CPC酰基轉移酶可包含通過進行選自由以下組成的組中的至少一種(一種、兩種、三種、四種或五種)取代而發生的突變：