[發明專利]維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法及抑制劑的應用

在審

• 申請號: 202211566361.3
• 申請日: 2022-12-07
• 公開（公告）號: CN116286613A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 陳鎮洲;林冬妮;顏楷濠;賀祺瑋;陳俊雄
• 申請（專利權）人: 陳鎮洲
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074
• 代理公司: 深圳科灣知識產權代理事務所(普通合伙) 44585
• 代理人: 馬垚

本發明公開了維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法及抑制劑的應用，所述維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法包括以下步驟：S1、在培養箱中建立EPCs體外培養體系；S2、在EPCs體外培養體系中加入抑制劑；S3、通過抑制劑促進EPCs體外培養體系中細胞的有氧糖酵解，提高細胞增殖能力及成血管能力，維持了干細胞的干性。所述抑制劑的應用為：所述抑制劑可應用于EPCs體外培養體系中來促進細胞的有氧糖酵解。本發明有利于提高EPCs體外擴增的速率，保持干細胞的干性，其可以改進EPCs體外擴增再回輸治療缺血性疾病的治療技術平臺，具有明確的臨床轉化應用價值。

技術領域

本發明涉及生物學領域，尤其涉及維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法及抑制劑的應用。

背景技術

血管內皮祖細胞(Endothelial?progenitor?cells,EPCs)是來源于骨髓的一種前體細胞，能增殖、分化為成熟的血管內皮細胞。其來源豐富，取材簡單，沒有倫理爭議，可以自體移植因而避免了可能的免疫排斥反應等優勢。大量的動物實驗已經證明了這種細胞對多種缺血性疾病治療的安全性及有效性，而且，EPCs被應用于多種疾病治療的臨床試驗，如心肌梗塞、肝硬化、肢體缺血、特發性肺動脈高壓、以及本發明開展的治療腦缺血的臨床研究，都顯示了其良好的臨床應用前景。

EPCs在健康個體外周血中數量是很少的，而且，EPCs的數量與Framingham心血管危險指數負相關。然而，EPCs移植治療的最大需求人群恰恰是缺血性疾病的高發人群，比如，高齡、存在心血管疾病危險因素的病人，其EPCs的數量及遷移修復性能均顯著下降。因此，本發明認為在ex?vivo體外擴增EPCs再自體回輸這一干細胞療法向臨床轉化的過程中，如何提高EPCs體外擴增的效率，保持干細胞的干性(Stemness)，這對于提高對EPCs生物學特性的認識，提高移植治療的效果具有重要的作用，具有良好的臨床轉化價值。

同大多數的細胞系或干細胞培養方法一樣，目前所廣泛采用的EPCs擴增方法仍然是在常規培養箱在“5％?CO₂,95％空氣”條件下培養(氧氣濃度20％)，這種狀態下的氧氣濃度被認為是“常氧(Normoxia)”。然而，需要注意到，干細胞在體內正常的生存的微環境(Niche)同常氧狀態有巨大的區別。空氣中的氧分壓(pO₂)為21％(160mmHg)，而經過呼吸、血循環，最后到達組織器官的pO₂已下降至2％～9％(14～65mmHg)。也就是說常氧下的氧分壓可能大大超過干細胞的正常需要量。過高的氧張力的危害是顯而易見的，細胞在有氧代謝時因氧化應激產生的活性氧簇(Reactive?oxygen?species,ROS)會損傷細胞的DNA，造成遺傳的不穩定性。比如，有證據顯示在小鼠胚胎成纖維細胞體外培養過程中，20％?O₂條件會比3％?O₂條件下加速積累更多的基因突變。經研究后發現，現在的傳統的常氧下的培養方法較1％低氧濃度下的培養，細胞增殖、克隆形成及成血管能力均有下降，而衰老指標增高，提示常氧環境下培養不利于維持EPCs的干細胞干性，因此，有必要針對上述問題進行改進。

發明內容

本發明目的是針對上述問題，提供一種操作簡單的通過在常氧培養體系中添加抑制劑來模擬低氧環境，無需改變培養箱氧深度，但能有效提高EPCs體外擴增效率的EPCs的維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法及抑制劑的應用。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：

一種維持人骨髓源EPCs干性的體外擴增方法，包括以下步驟：

S1、在培養箱中建立EPCs體外培養體系；

S2、在EPCs體外培養體系中加入抑制劑；

S3、通過抑制劑促進EPCs體外培養體系中細胞的有氧糖酵解，提高細胞增殖能力及成血管能力，維持了干細胞的干性。

進一步的，所述抑制劑為檸檬酸合酶抑制劑或α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑。