[發明專利]一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法

在審

• 申請號: 202211560607.6
• 申請日: 2022-12-07
• 公開（公告）號: CN115876811A
• 公開（公告）日: 2023-03-31
• 發明（設計）人: 謝禮;呂明芳;袁正杰;戴遠興;尚衛娜;郭建勝;洪健;張恒木
• 申請（專利權）人: 浙江大學;浙江省農業科學院
• 主分類號: G01N23/04
• 分類號: G01N23/04;G01N23/20;G01N33/58
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于:具體過程包括獲取透射電鏡膠體金標記圖片，然后在圖形工作站中對電鏡膠體金標記圖片進行預處理，對于預處理后的電鏡膠體金標記圖片采用參數依賴的半自動分割金顆粒并手動選取感興趣區域，然后計算感興趣區域內的真實金顆粒的面密度，面密度在60-140范圍內的電鏡膠體金標記被認定為適合后續平均最近鄰分析(ANNA)法的陽性標記數據，以此采用平均最近鄰分析(ANNA)法計算金顆粒的聚集程度，最終認定ANNA數值在0.6-1.4之間的電鏡膠體金標記為合格的陽性標記數據。

2.根據權利要求1所述的一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于：

所述預處理包括對所述電鏡膠體金標記圖片的亮度和對比度進行歸一化處理和圖片相位反轉處理。

3.根據權利要求2所述的一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于：

所述半自動分割金顆粒的具體過程為：

通過三組濾波器對待分割的真實金顆粒和假信號按尺寸因子參數進行篩選獲得電鏡圖片中所有真實膠體金顆粒模型gold total，三組濾波器分別為綜合尺寸和信號峰值、金顆粒與背景邊界的清晰度以及信號峰值。

4.根據權利要求3所述的一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于：

所述感興趣區域包括內層感興趣區域(ROI inner)和由內層感興趣區域(ROI inner)向外環形擴展的環形區域，向外擴展的環形區域為質量控制區(ROI peripheral)；內層感興趣區域(ROI inner)與質量控制區(ROI peripheral)之和為外層感興趣區域(ROIouter)。

5.根據權利要求4所述的一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于：

所述真實金顆粒的面密度的計算過程為：

獲取所述電鏡膠體金標記圖片的內層感興趣區域的體素inner Number of voxel、外層感興趣區域的體素outer Number of voxel、體素尺寸voxel size、內層感興趣區域的金顆粒數number of gold inner、外層感興趣區域的金顆粒數number of gold outer，voxelsize包括voxel X和voxel Y；然后依次進行如下計算：

(1)內層感興趣區域(ROI inner)的面積：

area of inner＝inner Number of voxel*voxel X*voxel Y (1)

(2)外層感興趣區域(ROI outer)的面積：

area of outer＝outer Number of voxel*voxel X*voxel Y (2)

(3)質量控制區(ROI peripheral)的面積：

area of peripheral＝area of outer-area of inner (3)

(4)基于距離閾值從所述所有真實膠體金顆粒模型gold total中分揀出內層感興趣區域(ROI inner)中分布的金顆粒模型，包括spots close to ROI inner模型和spots farto ROI inner模型；

基于距離閾值從所述所有真實膠體金顆粒模型中分揀出外層感興趣區域(ROI outer)中分布的金顆粒模型，包括spots close to ROI outer和spots far to ROI outer模型；

(5)質量控制區(ROI peripheral)中真實金顆粒模型的數量：

number of gold peripheral＝number of gold outer - number of gold inner(4)

(6)內層感興趣區域(ROI inner)中真實金顆粒的面密度：

areal density inner＝number of gold inner/area of inner (5)

(7)質量控制區(ROI peripheral)中真實金顆粒的面密度：

areal density peripheral＝number of gold peripheral/area of peripheral(6)

(8)背底扣除參數的計算：

ratio peripheral/inner＝areal density peripheral/areal density inner (7)

(9)扣除完背底后的真實金顆粒模型的面密度：

areal density＝ areal density inner- areal density peripheral (8)

(10)真實金顆粒的面密度areal density大于30個/平方微米的樣本被認定為陽性，選取areal density數值為60-140個/平方微米的樣本用于所述金顆粒的聚集程度的計算。

6.根據權利要求5所述的一種電子顯微鏡膠體金標記聚集程度定量分析的方法，其特征在于：

所述計算金顆粒的聚集程度的過程為：

(1)、顯示所述內層感興趣區域(ROI inner)內spots close to ROI inner模型并作為平均最近鄰分析(ANNA)法計算的金顆粒對象(gold ANNA)，以最外圍金顆粒模型的點連線形成一個封閉的折線區域作為平均最近鄰分析(ANNA)法的計算區域(ROI ANNA)；

(2)獲取平均最近鄰分析(ANNA)法的計算區域(ROI ANNA)的number of voxel參數；

(3)平均最近鄰分析(ANNA)法的計算區域(ROI ANNA)的面積計算：

area of ANNA＝number of voxel*voxel size (9)

(4)平均最近鄰分析(ANNA)法分析中回歸分析期望值De的計算：

其中Nr gold表示平均最近鄰分析(ANNA)法的計算區域(ROI ANNA)中金顆粒的個數；

(5)對平均最近鄰分析(ANNA)法中金顆粒的實際間距值進行測量，方法如下：依次平均最近鄰分析(ANNA)法的計算區域(ROI ANNA)中每一個金顆粒模型測量與其他每一個金顆粒模型的距離，得到數據組Distance₁、Distance₂……Distance_n，分別將數據組Distance₁、Distance₂……Distance_n中的最小值對應地記為最短間距Distance minimum₁、Distance minimum₂……Distance minimum_n，最后將最短間距Distance minimum₁、Distance minimum₂……Distance minimum_n的平均值作為實際間距值/

(6)、計算金顆粒的聚集程度參數：

(7)、ANNA值在0.6-1.4之間的樣本被認定為有效樣本。