[發明專利]一種固定化微生物顆粒及其制備方法及應用及包埋率檢測方法

在審

• 申請號: 202211542214.2
• 申請日: 2022-12-02
• 公開（公告）號: CN115851531A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 王強鋒;夏中梅;侯勇;王海濤;楊云月;胡甦
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院生物技術核技術研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N11/04;C12N11/10;C12N11/14;C12Q1/04;C12R1/125;C12R1/10
• 代理公司: 成都立新致創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 51277
• 代理人: 劉俊

1.一種固定化微生物顆粒，其特征在于，包括功能菌菌粉，營養物質，輔料，以及包埋載體的構建材料；

所述包埋載體的構建材料包括海藻酸鈉、鈣鹽、固體酸；

所述輔料包括填料；

所述營養物質包括碳源、氮源。

2.根據權利要求1中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：以質量份計，所述功能菌菌粉為1～20份、海藻酸鈉為5～30份、鈣鹽為5～20份、固體酸為0～40份、碳源為3～40份、氮源為2～20份、填料為10～40份。

3.根據權利要求2中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：所述的功能菌菌粉包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中的一種或兩種。

4.根據權利要求2中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：所述的鈣鹽為難溶性鈣鹽；

所述難溶性鈣鹽包括但不限于乳酸鈣、葡萄糖酸鈣、EDTA-Ca、碳酸鈣、檸檬酸鈣中的一種。

5.根據權利要求2中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：所述的固體酸包括但不限于氨基磺酸或檸檬酸。

6.根據權利要求2中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：所述的碳源為葡萄糖、蔗糖、糖蜜、甘露醇、淀粉中的一種或多種；

所述的氮源為蛋白胨、黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、酵母粉、魚粉、硫酸銨中的一種或多種。

7.根據權利要求2中所述的一種固定化微生物顆粒，其特征在于：所述的填料包括但不限于硅藻土、白炭黑、淀粉、腐殖酸中的一種或多種。

8.一種用于制備權利要求1～7任一項所的固定化微生物顆粒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟S1、混合原料

將功能菌菌粉、海藻酸鈉、鈣鹽、固體酸、碳源、氮源、填料按配方比例混合均勻；

步驟S2、造粒

將步驟S1中混合均勻的原料放入造粒機造粒，制得固定化微生物顆粒。

9.一種固定化微生物顆粒的應用，其特征在于：是將權利要求1～8任一項所述的固定化微生物顆粒放入土壤中，遇水即可生成海藻酸鈣凝膠將菌體包埋，形成微膠囊包埋顆粒。

10.一種固定化微生物顆粒的包埋率檢測方法，其特征在于，用于測定權利要求1～9任一項所述固定化微生物顆粒的包埋率，該方法包括以下步驟：

A、配制0.2mol/L的檸檬酸鈉溶液，分裝成數瓶，每瓶100mL，每瓶裝入10～20粒瓷珠，備用；

配制數瓶無菌水，每瓶100mL，備用；

準備數根50mL離心管，121℃滅菌20min，冷卻后備用；

B、制備微膠囊包埋顆粒

向滅菌后的離心管中加入10g固定化微生物顆粒，加入40mL已滅菌的無菌水，室溫靜置1h，得到微膠囊包埋顆粒；

C、微膠囊包埋顆粒溶解

將微膠囊包埋顆粒3000rpm/min離心10min，除去上清液，得到的沉淀用無菌水反復清洗3次；

設置實驗組、對照組，實驗組：將無菌水反復清洗后的沉淀移至步驟A配制的100mL0.2mol/L的檸檬酸鈉溶液中，35℃，150rpm/min振蕩2h；

對照組：將實驗組的檸檬酸鈉換成步驟A配置的無菌水，按實驗組相同方式處理；

D、實驗組：待微膠囊包埋顆粒在0.2mol/L檸檬酸鈉溶液中完全溶解后，用0.2mol/L檸檬酸鈉溶液梯度稀釋；取3個連續的稀釋度，分別涂布于對應的選擇性培養基平板上，每個稀釋度重復3次，35℃培養24h；

對照組：將實驗組的檸檬酸鈉換成無菌水，按實驗組相同方式處理；

E、將經步驟D處理后的實驗組、對照組分別培養24h后，同一稀釋度的三個平板菌落數均符合20～300個標準時，以該稀釋度的平板作為計數標準；

當三個稀釋度中只有一個稀釋度符合計數標準時，以該稀釋度的平均菌落數計算活菌數；

當三個稀釋度中有兩個稀釋度符合計數標準時，按兩者菌落總數的比值確定，兩者比值≤2時則計算兩者平均菌落數為活菌數，兩者比值＞2時則以稀釋度小的平均菌落數計算活菌數；

當三個稀釋度均符合計數標準時，以最小稀釋度的平均菌落數計算活菌數；

包埋率M計算公式：

M＝(A-a)/A*100％

其中：A—用0.2mol/L檸檬酸鈉處理的樣品中的活菌數(個/mL)

a—用無菌水處理的樣品中的活菌數(個/mL)；

其中，所述的步驟C微膠囊包埋顆粒溶解還可以是：

將微膠囊包埋顆粒3000rpm/min離心10min，除去上清液，得到的沉淀用無菌水反復清洗3次；

設置實驗組、對照組，實驗組：將無菌水反復清洗后的沉淀移至100mL 0.2mol/L的檸檬酸鈉溶液中靜置至完全溶解；對照組：將實驗組的檸檬酸鈉換成無菌水，按實驗組相同方式處理。