[發明專利]一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法

在審

• 申請號: 202211539660.8
• 申請日: 2022-12-02
• 公開（公告）號: CN115948471A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 陳瑞愛;李作生;劉郁夫;容芳;郝文茜;馮夏寧
• 申請（專利權）人: 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/44;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

1.一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法，其特征在于，包括如下制備步驟：

(1)目的基因設計與合成：在H5亞型禽流感病毒的HA蛋白序列的起始密碼子之前設計Kozac序列和BamHI酶切位點，并將HA的血凝素信號肽序列替換成蜂毒素信號肽序列，在肽鏈C端設計6×His組氨酸標簽和HindIII酶切位點，得到目的基因HA；

(2)桿狀病毒供體質粒pFastBac-HA-M1的構建：使用BamHI和HindIII雙酶切，將目的基因HA和M1蛋白序列分別克隆至桿狀病毒穿梭質粒pFastBac1-dual，然后轉化至DH5α感受態細胞中，鑒定正確的質粒命名為pFastBac-HA-M1；

(3)重組桿狀病毒Bacmid-HA-M1的拯救：將桿狀病毒供體質粒pFastBac-HA-M1加入到DH10Bac感受態細胞中培養，提取得到重組桿粒Bacmid-HA-M1；

(4)病毒樣顆粒的表達制備：將重組桿粒Bacmid-HA-M1轉染至SF9昆蟲細胞進行VLPs表達制備。

2.根據權利要求1所述的一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述培養步驟為：向剛化凍的DH10Bac感受態細胞中加入桿狀病毒供體質粒pFastBac-HA-M110ng，于冰上靜置30min后，置于42℃水浴鍋熱擊90s，之后向感受態細胞加入900μL不含抗生素的SOC培養基，并置于37℃搖床振蕩培養4h，取50μL菌液涂布于抗性LB平板中，37℃溫箱培養20h。

3.根據權利要求2所述的一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法，其特征在于，所述抗性LB平板中含卡那霉素50μg/mL、四環素10μg/mL、慶大霉素7μg/mL、IPTG125μg/mL、X-gal?100μg/mL。

4.根據權利要求1所述的一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述提取步驟為：根據BAC/PAC?DNA小量提取試劑盒D2156說明書抽提重組HA基因的桿狀病毒桿粒Bacmid-HA-M1，檢測核酸濃度后置于-20冰箱保存備用。

5.根據權利要求1所述的一種H5亞型禽流感病毒病毒樣顆粒的表達制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述轉染至SF9昆蟲細胞進行VLPs表達制備的具體步驟為：將處于對數生長期的SF9昆蟲細胞以1×10⁶個細胞每孔的密度傳至6孔細胞培養板，置于27℃溫箱培養12h，取3μg的桿粒Bacmid-HA-M1，以脂質體轉染的方式將桿粒轉染到SF9細胞，轉染后培養至96h，細胞經凍融3次后離心取上清，并在SF9細胞中連續盲傳3代，直至產生SF9細胞病變。