[發明專利]化合物下拉靶點蛋白的方法

在審

• 申請號: 202211539527.2
• 申請日: 2022-12-02
• 公開（公告）號: CN115754306A
• 公開（公告）日: 2023-03-07
• 發明（設計）人: 趙苗苗;楊仁君;殷諾雅;費凡
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/535;G01N33/543
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 郭夢雅

1.一種化合物下拉靶點蛋白的方法，包括以下步驟：

利用裂解液處理細胞得到細胞總蛋白，其中所述裂解液包括蛋白酶抑制劑；

利用蛋白G/A磁珠對所述細胞總蛋白進行預處理，得到待測細胞總蛋白，以去除所述細胞總蛋白中非特異結合的蛋白；

在含有牛血清蛋白的下拉緩沖液中利用生物素標記化合物對親和素磁珠進行預處理，得到結合有所述生物素標記化合物的親和素磁珠體，其中，所述生物素標記化合物為生物素標記的所述化合物；

將預處理后得到的所述親和素磁珠體加至所述待測細胞總蛋白中進行孵育處理，得到捕獲有特異性靶點蛋白的親和素磁珠體；

利用所述生物素或未被生物素標記的所述化合物對孵育處理后得到的所述親和素磁珠體進行處理，得到目標下拉靶點蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用裂解液處理細胞得到細胞總蛋白的步驟包括：

利用低溫離心的方法對培養后的所述細胞進行收集，其中，所述細胞的培養密度優選為≥3.8×10⁵個細胞/cm²，所述細胞包括哺乳動物細胞，優選為，人多能誘導干細胞；

將收集的所述細胞利用所述裂解液進行裂解，得到所述細胞總蛋白，所述裂解的時間為10～30分鐘。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用蛋白G/A磁珠對所述細胞總蛋白進行預處理，得到待測細胞總蛋白包括：

利用下拉緩沖液對所述細胞總蛋白進行稀釋，得到所述細胞總蛋白的稀釋液；

將所述細胞總蛋白的稀釋液加入經清洗后的蛋白G/A磁珠中，在低溫環境中進行孵育，所述孵育時間為2～8小時，所述低溫環境的溫度范圍為4～8℃。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述在含有牛血清蛋白的下拉緩沖液中利用生物素標記化合物對親和素磁珠進行預處理，得到結合有所述生物素標記化合物的親和素磁珠體，包括：

將所述親和素磁珠和生物素標記化合物置于含有牛血清蛋白的下拉緩沖溶液中在低溫條件下進行孵育處理，以便將所述生物素標記化合物包被至所述親和素磁珠體表面的同時，封閉所述親和素磁珠體的潛在非特異性蛋白結合位點，得到結合有所述生物素標記化合物的親和素磁珠體，其中，所述牛血清蛋白的含量百分比為0.5～5％，所述孵育處理時間為3～8小時，所述低溫的溫度范圍為4～8℃。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述下拉緩沖液包括HEPES，甘油，KCl，MgCl₂和EDTA。其中，HEPES的濃度為5～20mM，甘油的體積百分比為15～30％，KCl的濃度為95～105mM，MgCl₂的濃度為1～2mM，EDTA的濃度為0.1～0.3mM。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述將預處理后得到的所述親和素磁珠體加至所述待測細胞總蛋白中進行孵育處理，得到捕獲有特異性靶點蛋白的親和素磁珠體，包括：

將預處理后得到的所述親和素磁珠體至所述待測細胞總蛋白中，置于低溫環境中進行孵育處理，以便對所述化合物對應的特異性靶點蛋白進行捕獲，得到捕獲有特異性靶點蛋白的親和素磁珠體，其中所述孵育處理時間為2～10小時，所述低溫環境的溫度范圍為4～8℃。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用所述生物素或未被生物素標記的所述化合物對孵育處理后得到的所述親和素磁珠體進行處理，得到目標下拉靶點蛋白，包括：

將所述生物素或未被生物素標記的所述化合物與所述孵育處理后得到的所述親和素磁珠體在下拉緩沖液中進行混合后，置于冰上輕彈混勻處理以完成競爭性洗脫，收集上清液，得到所述目標下拉靶點蛋白，其中所述處理時間為20～40分鐘。