[發(fā)明專利]一種水解制備(+)γ-內(nèi)酰胺的方法

在審

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• 申請日: 2022-11-30
• 公開（公告）號: CN115786316A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 遲乃玉;劉春瑩;王倩倩;張慶芳
• 申請（專利權(quán)）人: 大連大學(xué)
• 主分類號: C12N9/86
• 分類號: C12N9/86;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 大連智高專利事務(wù)所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種水解制備(+)γ?內(nèi)酰胺的方法，包括以下四個步驟：微生物發(fā)酵產(chǎn)(?)γ?內(nèi)酰胺酶、粗酶液的獲得、酶液濃縮和生產(chǎn)(?)γ?內(nèi)酰胺，本發(fā)明利用超濾管及透析袋濃縮(?)γ?內(nèi)酰胺酶液，較傳統(tǒng)濃縮酶液的方法具有操作簡單，成本低，高酶活回收率的優(yōu)勢，超濾管濃縮酶液節(jié)約時間，且能重復(fù)利用；采用高濃度酶液生產(chǎn)(+)γ?內(nèi)酰胺效率高，快速，大大降低了生產(chǎn)成本；采用向轉(zhuǎn)化體系中加入適量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隱患；轉(zhuǎn)化體系經(jīng)過實驗優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水解制備(+)γ-內(nèi)酰胺的方法，具體涉及一種微生物不對稱水解制備(+)γ-內(nèi)酰胺的方法。

背景技術(shù)

γ-內(nèi)酰胺酶是酰胺酶的一種，由于其能選擇性降解工業(yè)上的(±)γ-內(nèi)酰胺，因而被命名為γ-內(nèi)酰胺酶。(±)γ-內(nèi)酰胺則是一種可以合成數(shù)十種藥物的醫(yī)藥中間體，如治療艾滋病的阿巴卡韋以及治療甲型流感的帕拉米韋。γ-內(nèi)酰胺市場需求巨大，但(±)γ-內(nèi)酰胺自身卻是外消旋體，包含(±)兩種旋光構(gòu)型：(+)γ-內(nèi)酰胺以及(-)γ-內(nèi)酰胺。臨床上已知阿巴卡韋的藥理活性來源于(-)阿巴卡韋，因而科學(xué)工作者們的目光都鎖定在了挖掘(+)γ-內(nèi)酰胺酶上，試圖利用(+)γ-內(nèi)酰胺酶拆分(±)γ-內(nèi)酰胺，從而得到光學(xué)純的(-)γ-內(nèi)酰胺以滿足生產(chǎn)需要。但實際上(+)γ-內(nèi)酰胺也可以通過溴化作用實現(xiàn)構(gòu)型翻轉(zhuǎn)，因而(+)γ-內(nèi)酰胺在工業(yè)應(yīng)用上同樣具有價值。

目前制備單構(gòu)型γ-內(nèi)酰胺的方法主要有不對稱合成法和外消旋體拆分法，外消旋拆分法又包括循環(huán)優(yōu)先結(jié)晶法和生物不對稱拆分法。不對稱合成法是創(chuàng)造一個不對稱的反應(yīng)條件或環(huán)境，使反應(yīng)按一定的方向進行，從而使兩個對映體中的一個占優(yōu)勢的合成方法，但這種方法效果很差。循環(huán)優(yōu)先結(jié)晶法操作太過繁瑣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，且存在產(chǎn)率低等問題。

發(fā)明內(nèi)容

生物法具有反應(yīng)條件溫和，效率高，立體選擇性高，環(huán)境友好，利于工業(yè)放大等等優(yōu)點。本發(fā)明的目的在于提供一種水解制備(+)γ-內(nèi)酰胺的方法，通過調(diào)控優(yōu)化微生物產(chǎn)酶、對酶液進行濃縮，轉(zhuǎn)化過程中采取抑菌措施，進而能高效、安全的降解(±)γ-內(nèi)酰胺生產(chǎn)(+)γ-內(nèi)酰胺產(chǎn)品。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種水解制備(+)γ-內(nèi)酰胺的方法，包括以下步驟：

步驟一、微生物發(fā)酵產(chǎn)(-)γ-內(nèi)酰胺酶

選產(chǎn)(-)γ-內(nèi)酰胺酶的菌株作為種子，經(jīng)28℃、150r/min培養(yǎng)得種子液，再以體積分數(shù)2.0％～8.0％接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，裝液量15％～35％，培養(yǎng)溫度25℃～32℃，轉(zhuǎn)速為110～180rpm，通氣量1vvm～3vvm，初始pH5.0～9.0，發(fā)酵20～60h后收集發(fā)酵液；

步驟二、粗酶液的獲得

將步驟一獲得的發(fā)酵液低溫高速離心，分離菌體，收集菌體，得到的濕菌體經(jīng)磷酸鈉緩沖液洗滌3次，將菌體懸于磷酸鈉緩沖液中，進行細胞破碎，破碎后10000rpm離心，取上清液為粗酶液，低溫儲存，備用；

步驟三、酶液濃縮

將步驟二所得的(-)γ-內(nèi)酰胺酶粗酶液，低溫透析濃縮得到濃縮酶液，濃縮時使用10kD離心超濾管；測粗酶液和濃縮酶液酶活，計算回收率；

步驟四、生產(chǎn)(-)γ-內(nèi)酰胺

利用步驟三中獲得的濃縮酶液無菌轉(zhuǎn)化(±)γ-內(nèi)酰胺；其中，轉(zhuǎn)化體系的溫度為24℃～35℃，攪拌速度為150rpm，轉(zhuǎn)化24～60h，并向轉(zhuǎn)化體系中加入抗生素，得到的(-)γ-內(nèi)酰胺用液相法檢測濃度。