[發(fā)明專利]一種介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211528069.2
• 申請日: 2022-12-01
• 公開（公告）號: CN116083533A
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設計）人: 許永杰;羅潔;彭睿;詹琳;達靜靜;查艷
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/682
• 分類號: C12Q1/682;C12Q1/6825
• 代理公司: 遵義市創(chuàng)先知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 52118
• 代理人: 劉創(chuàng)先

1.一種介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：包括以下步驟：

（1）篩選模板探針：選擇巰基化雙鏈捕獲探針為模板探針，其探針模板中在其中間區(qū)域設計CRISPR?RNA靶向序列，并通過兩個金硫鍵固定在金電極表面，該模板探針也設計了由分別與microRNA靶標、T7?RNA聚合酶識別位點和CRISPR?RNA互補的序列區(qū)組成；

（2）生物探針制備金電極界面制備：用水虎魚溶液（H₂SO₄:H₂O₂=3:1）處理金電極，之后分別用0.3?μM和0.05?μM的鋁粉在鹿皮上打磨5?min，接著使用去離子水清洗進電極表面，并用洗耳球將進金電極表面吹干，然后將雙鏈捕獲探針滴加于電極表面，并于4?℃冰箱過夜處置，以促使雙鏈探針錨定于金電極表面，制備金電極備用后續(xù)檢測；

（3）瓊脂糖電泳實驗：稱取1.0克瓊脂糖粉加入0.5×TBE緩沖液50?mL中，配制成2%瓊脂糖凝膠，在電泳電壓110?V，電泳時間30?min，電泳后瓊脂糖凝膠在凝膠成像系統(tǒng)紫外光照射下拍照；

（4）電化學檢測：電極表面清洗后，金電極置于含α-萘酚底物溶液（1?mg/mL）中60秒，在掃描電壓0-0.5V間進行電化學信號檢測，記錄實驗結果。

2.根據(jù)權利要求1所述的介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：所述電化學檢測中電極表面分別為a、b、c、d，其表面電極制備過程為：

①制備裸金電極（a）；

②所述雙鏈捕獲探針固定于金電極表面（b）；

③所述基乙醇封閉于金電極表面（c）；

④所述胎牛血清封閉金電極表面（d）。

3.根據(jù)權利要求1所述的介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：為了證明DNA四面體結構信號放大標簽是否被構建，對其DNA組裝過程進行了瓊脂糖電泳實驗。

4.根據(jù)權利要求1所述的介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：采用評估差分脈沖伏安法（Differential?pulsevoltammetry,?DPV）反應在不同條件下的可行性，驗證生物傳感器的可行性結果。

5.根據(jù)權利要求1所述的介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：為了證明單鏈模板探針P在DNA聚合酶和miRNA-21存在下是否被延伸為雙鏈，以及T7?RNA聚合酶識別其結合位點后是否大量產(chǎn)生sgRNA，進行了瓊脂糖電泳實驗，實驗中泳道1：microRNA-21；泳道2：具有144個核苷酸的模板探針，出現(xiàn)低于150?bp的條帶；泳道3：是一個包含模板+miR-21的系統(tǒng)，顯示出更亮的條帶，遷移速率略慢，表明引物和模板的雜交；泳道4：含有模板P、miR-21、DNA聚合酶和dNTPs混合物反應體系，顯示出更亮的條帶，遷移速率略慢，表明引物沿模板延伸并形成雙鏈模板；泳道5含模板P、miR-21、DNA聚合酶、dNTPs混合物、rNTPs混合物以及RNase抑制劑和T7?RNA聚合酶的反應體系，在100?bp的分子量處出現(xiàn)了新的條帶，證明重組酶聚合酶擴增產(chǎn)生CRISPER?RNA；泳道6為泳道5系統(tǒng)去除mir-21的情況；泳道7是5000?bp?DNAmarker。

6.根據(jù)權利要求3所述的介導雙鏈探針特異捕獲四面體信號放大標簽的外泌體microRNA電化學檢測方法，其特征是：該瓊脂糖電泳實驗結果為泳道1為組裝鏈A，泳道2為組裝鏈B，泳道3為組裝鏈C，泳道4為組裝鏈為D，泳道5為組裝鏈A+B，泳道6為組裝鏈A+B+C，泳道7為組裝鏈A+B+C+D，泳道1至泳道7電泳條帶逐步后置。