[發明專利]Sal作為m6A RNA甲基化修飾的促進劑的應用

在審

• 申請號: 202211526901.5
• 申請日: 2022-11-28
• 公開（公告）號: CN116159058A
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 陳薛釵;王佳楠
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: A61K31/472
• 分類號: A61K31/472;G01N33/53;C12Q1/66;C12N15/85;C12N15/53;A61P25/16
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 張立改

Sal作為m6A?RNA甲基化修飾的促進劑的應用，屬于RNA表觀遺傳修飾領域。Salsolinol(Sal)是一種兒茶酚異喹啉類化合物，可能作為神經毒素在帕金森病的發生發展中發揮作用。本發明公開了Sal作為表觀遺傳調節劑的新用途，通過抑制m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的表達，上調多巴胺能神經細胞中m6A?RNA甲基化修飾水平；并且Sal對FTO和ALKBH5產生抑制作用具有一定濃度依賴性，200μM時達到顯著抑制作用。本研究揭示了Sal作為多巴胺能神經細胞m6ARNA甲基化修飾的促進劑，為表觀遺傳修飾在帕金森病中的研究提供借鑒。

技術領域

本發明屬于RNA表觀遺傳修飾領域，具體涉及兒茶酚異喹啉類化合物Salsolinol能夠促進多巴胺能神經細胞總RNA和mRNA上發生N6-腺苷酸甲基化修飾(m6A)。

背景技術

m6ARNA甲基化修飾是指在核糖核苷酸腺嘌呤堿基(A)的6號氮原子形成6-甲基腺嘌呤(m6A)，在真核生物mRNA甲基化修飾中占比超80％。在RNA甲基化酶(METTL3/METTL14/WTAP等)和去甲基化酶(FTO/ALKBH5)的作用下，m6A?RNA甲基化修飾可實現動態可逆調節，并通過m6A識別蛋白(Readers)調控RNA的剪切、穩定性和翻譯等發揮生物學功能。目前已發現的m6A促進劑主要通過與去甲基化酶競爭結合m6A從而抑制其去甲基化酶活性，如：恩他卡朋(Entacapone)通過與FTO蛋白直接結合抑制其去甲基化酶活性；IOX1是2OG氧合酶的一種廣譜抑制劑，用于抑制ALKBH5，但具體機制尚不明確。

Salsolinol(1-甲基-4-苯基-1,2,3,4-四氫異喹啉，Sal)又稱去甲豬毛菜堿，是一種兒茶酚異喹啉類化合物(CTIQs)。Sal及其衍生物N-甲基-Salsolinol(NM-Sal)與帕金森病(Parkinson’s?disease,PD)環境毒素MPTP結構類似，體外研究中，Sal可以增加細胞內的氧化應激水平，加劇活性氧(reactive?oxygen?species，ROS)的生成，導致線粒體功能紊亂；向鼠腦紋狀體區注射NM-Sal可以顯著引起多巴胺能神經元的選擇性缺失。這些證據表明Sal及其衍生物可能參與了PD的發生發展，因此受到人們廣泛關注。研究顯示，RNA表觀遺傳修飾可能參與PD的調控，然而，目前尚未有關于Sal在RNA表觀遺傳學修飾方面的研究報道。

發明內容

本研究是發現去甲豬毛菜堿是一種可以促進多巴胺能神經細胞中m6A?RNA甲基化修飾的小分子化合物。研究顯示，Sal通過抑制m6A去甲基化酶FTO和ALKBH5的啟動子活性從而抑制其表達，進而上調多巴胺能神經細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，PC12)中m6A?RNA甲基化修飾水平。

去甲豬毛菜堿作為m6A?RNA甲基化修飾的促進劑的應用的研究步驟和效果表達如下：(1)將Sal溶于PBS中，然后加入細胞(多巴胺能神經細胞)，Sal在濃度為200μM時可顯著抑制去甲基化酶FTO和ALKBH5在mRNA水平和蛋白水平的表達(圖1)；一般濃度越大效果越好。

(2)對步驟(1)中經200μM?Sal處理的多巴胺能神經細胞中的總RNA和mRNA進行提取，采用Dot-Blot的方法對m6A水平進行檢測。首先采用亞甲基藍染色結果證明RNA樣品通過點樣，成功附著于硝酸纖維膜(NC膜)上，然后采用m6A抗體進行免疫雜交，結果表明，Sal上調了總RNA和總mRNA中m6A含量(圖2)。

(3)調取FTO和ALKBH5兩種去甲基化酶的啟動子序列(圖3)并通過分子生物學方法將其連接到pGL3-Basic質粒中。pGL3-Basic質粒中具有熒光素酶(Firefly?luciferase)的表達序列，將轉錄調控元件即FTO或ALKBH5的啟動子序列插入到表達熒光素酶基因序列的前端，分別構建pGL3-FTO-promoter和pGL3-ALKBH5-promoter兩種質粒，質粒結構如圖4所示。