[發(fā)明專利]一種豬藍(lán)耳類歐洲株的熒光探針引物、試劑盒及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211525694.1
• 申請(qǐng)日: 2022-11-30
• 公開（公告）號(hào): CN115852054A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張蓉;蔣葉林;莊祥玲;吳俊;凌勇;鄧政;丁能水;萬(wàn)文峰;龔先貴;吳有林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司;福建傲芯種業(yè)科技集團(tuán)有限公司;漳州傲農(nóng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司;南寧傲農(nóng)育種技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

1.一種豬藍(lán)耳類歐洲株的引物探針組，其特征在于，所述引物探針組包括：

上游引物L(fēng)V-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’；

下游引物L(fēng)V-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’；

熒光探針引物L(fēng)V-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’，其中5’端添加報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端添加淬滅基團(tuán)MGB。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬藍(lán)耳類歐洲株的引物探針組，其特征在于，還包括動(dòng)物源性內(nèi)參的引物探針組，所述引物探針組包括：

上游引物L(fēng)13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’；

下游引物L(fēng)13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’；

熒光探針引物L(fēng)13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’，其中5’端添加報(bào)告基團(tuán)HEX，3’端添加淬滅基團(tuán)BHQ1。

3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、引物預(yù)混液、探針預(yù)混液、PCR擴(kuò)增液，酶預(yù)混液；

所述引物預(yù)混液包括LV-F、LV-R、L13a-F和L13a-R，

LV-F:5’-TCCCCGAACTGAAGGGCTGA-3’，

LV-R:5’-CTGGCTGGGTCCACGGTAGG-3’，

L13a-F:5’-GTGGCCAAGCAGGTACTTC-3’，

L13a-R:5’-CCAGGTACTTCAGTTTGTTT-3’；

所述探針預(yù)混液包括LV-P和L13a-P，

LV-P:5’-ATCGCCATCAGAGAAAGCATT-3’，其中5’端添加報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端添加淬滅基團(tuán)MGB，

L13a-P:5’-CTGGGCCGGAAGGTGGTGGTTGTGC-3’，其中5’端添加報(bào)告基團(tuán)HEX，3’端添加淬滅基團(tuán)BHQ1。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性對(duì)照為含有藍(lán)耳歐洲株和動(dòng)物源內(nèi)參基因L13a基因片段的重組質(zhì)粒；

所述陰性對(duì)照為雙蒸水；

所述PCR擴(kuò)增液為南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)的2×One Step U⁺；

所述酶預(yù)混液為南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)的One Step U⁺Enzyme Mix。

5.一種如權(quán)利要求3所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)樣品的總RNA備用；

(2)以步驟(1)中得到的總RNA為模板，利用試劑盒配置熒光反應(yīng)體系進(jìn)行熒光擴(kuò)增作為實(shí)驗(yàn)組；以陰性對(duì)照為模板，利用試劑盒配置熒光反應(yīng)體系進(jìn)行熒光擴(kuò)增作為陰性對(duì)照組；以陽(yáng)性對(duì)照為模板，利用試劑盒配置熒光反應(yīng)體系進(jìn)行熒光擴(kuò)增作為陽(yáng)性對(duì)照組；

(3)根據(jù)步驟(2)的熒光擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果判定待測(cè)樣品為藍(lán)耳歐洲株和/或動(dòng)物源性內(nèi)參核酸陽(yáng)性或陰性。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)中，以熒光反應(yīng)體系總體積為30μL計(jì)，實(shí)驗(yàn)組包括樣品總RNA6μL，引物預(yù)混液2.4μL(400nM)，探針預(yù)混液0.6μL(100nM)，PCR擴(kuò)增液15μL，酶預(yù)混液1.5μL，ddH₂O 4.5μL；

陰性對(duì)照組包括引物預(yù)混液2.4μL，探針預(yù)混液0.6μL，PCR擴(kuò)增液15μL，酶預(yù)混液1.5μL，ddH2O 10.5μL；

陽(yáng)性對(duì)照組包括含有藍(lán)耳歐洲株和動(dòng)物源內(nèi)參基因L13a基因片段的重組質(zhì)粒6μL，引物預(yù)混液2.4μL，探針預(yù)混液0.6μL，PCR擴(kuò)增液15μL，酶預(yù)混液1.5μL，ddH2O 4.5μL。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，所述引物預(yù)混液包括初始濃度為10μM的LV-F、LV-R、L13a-F、L13a-R摩爾比為1:1:1:1的預(yù)混液。