[發明專利]一種鼠李糖基水解酶突變體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202211525659.X
• 申請日: 2022-11-29
• 公開（公告）號: CN116121226A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 黃佳俊;李慧靈;胡浩軒;周金林;盧宇靖;鮑雅丹
• 申請（專利權）人: 廣東金駿康生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/70;C12N15/81;C12P19/60;C12P19/14;C12P17/06
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙) 44288
• 代理人: 楊艷

本發明公開了一種鼠李糖基水解酶突變體，所述鼠李糖基水解酶突變體為鼠李糖苷酶TpeRha的第513的賴氨酸發生突變；所述位點突變為具有疏水性側鏈的氨基酸；所述突變體K513A、突變體K513V的水解效率分別比野生型提高2.39倍和6.27倍；本發明還公開了一種鼠李糖基水解酶突變體的制備方法；本發明還公開了改鼠李糖基水解酶突變體的應用，所述鼠李糖基水解酶突變體用于制備橙皮素?7?O?葡萄糖苷、橙皮素或兩者的組合物。

技術領域

本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及一種鼠李糖基水解酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

橙皮素-7-O-葡萄糖苷，分子式為C₂₂H₂₄O₁₁，是柑橘類黃酮中的其中一種成分。近年來，對橙皮素-7-O-葡萄糖苷研究更加深入，研究結果表明，橙皮素-7-O-葡萄糖苷的吸收時間比橙皮苷和新橙皮苷更短，生物利用度更高，且橙皮素-7-O-葡萄糖苷在進入動物體內后，還具備益生元的特性，能促進腸道益生菌的生長，增加菌群代謝產物短鏈脂肪酸的含量，發揮著抗擊腸炎的實際效果，起到解決腸道問題的作用。

橙皮素-7-O-葡萄糖苷通常由橙皮苷或新橙皮苷，通過α-L-鼠李糖苷酶脫掉一份子鼠李糖后形成。α-L-鼠李糖苷酶能夠將以醇羥基和半縮醛反應形成的糖苷鍵以外切或內切的方式斷裂，從而效地定向水解含有鼠李糖苷的天然活性物質，例如橙皮苷。然而，α-L-鼠李糖苷酶在進行規模化應用時仍然存在較大的技術壁壘，天然的α-L-鼠李糖苷酶活力不足，且其反應環境往往難以滿足天然酶的最優條件。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的第一個目的在于提供一種鼠李糖基水解酶突變體，其能解決鼠李糖苷酶活力不足的問題。

一種鼠李糖基水解酶突變體，所述鼠李糖基水解酶突變體為將氨基酸序列如SEQID?NO：2所示的TpeRha酶的第513位的賴氨酸突變為具有疏水性側鏈的氨基酸。

進一步地，所述具有疏水性側鏈的氨基酸為丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸的其中一種。

進一步地，所述TpeRha酶第513位的賴氨酸突變為丙氨酸得到突變體K513A,氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示；所述TpeRha酶第513位的賴氨酸突變為纈氨酸得到突變體K513V，氨基酸序列如SEQ?ID?NO：6所示。

進一步地，編碼所述突變體K513A基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO：3所示；編碼所述突變體K513V基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

進一步地，所述TpeRha酶來源于石油熱袍菌DSM?13995。

本發明的第二個目的在于提供一種鼠李糖基水解酶突變體的制備方法，其能解決高活力的鼠李糖苷酶制備的問題。

一種鼠李糖基水解酶突變體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、將待突變的TpeRha酶的編碼基因連接到質粒中，得到重組質粒；

步驟2、設計并利用定點突變引物，以重組質粒為模板進行擴增，酶切后得到突變產物；所述定點突變引物對TpeRha酶的第513位的賴氨酸進行突變；

步驟3、將突變產物轉化至宿主細胞中，篩選和誘導宿主細胞表達得到鼠李糖基水解酶突變體。